白癜风黑素细胞凋亡小体形成及自身抗原再定位的分子机制研究

发布时间：2020-11-20 21:38

　　 背景白癜风是一种常见的以皮肤黑素细胞破坏为特征的色素脱失性疾病,该病发病机制尚不明确。近年来研究表明:氧化应激诱导所致的凋亡可能在表皮黑素细胞损伤中起到起始作用,凋亡的黑素细胞蛋白具有免疫源性,可以诱导针对自身抗原的免疫应答,继而造成黑素细胞免疫损伤,加剧黑素细胞破坏,导致白癜风的发生。另外,白癜风皮损周可见细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)浸润,可靶向杀伤黑素细胞,且白癜风患者血液中含有针对黑素细胞的特异性抗体,以上证据提示细胞、体液免疫应答是黑素细胞破坏的主要效应环节。前期诸多研究明确了特异性免疫应答所识别的白癜风相关抗原,但胞内抗原的暴露、识别、吞噬的分子机制尚不明确。凋亡小体(Apoptotic Bodies,ABs)的功能近年来逐渐被人们所关注,研究表明ABs包含自身免疫相关蛋白,主要包括热休克蛋白,组蛋白,表面蛋白烯醇化酶(Enolase)等。同时红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)相关研究也表明自身抗原在细胞凋亡过程中逐渐向细胞表面富集,抗原组分通过膜出泡的形式再定位于ABs,ABs进一步被周围的吞噬细胞或非专职呈递细胞所吞噬,形成自身抗原的免疫呈递,诱导免疫应答。在胰岛素瘤来源的间充质干细胞研究中,细胞外囊泡包含有自身抗原及免疫佐剂,可诱导T细胞应答。另外,Buzas等人研究发现,在应激及损伤等条件下,细胞释放ABs,内含损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs),可以诱导及维持炎症的发生和发展。这些研究提示,ABs是自身抗原及危险信号的重要载体,在自身免疫疾病中起着关键作用。这些发现对我们的白癜风研究带来了新的思考与探索,即氧化应激下黑素细胞是否也形成ABs,是否也包含相关自身抗原,是否也参与了白癜风的发生发展,ABs是否能成为连接氧化应激诱导凋亡与免疫介导黑素细胞破坏之间的桥梁?基于文献回顾和课题组以往研究,针对上述疑问,我们提出如下假设:氧化应激通过激活JNK、caspase等凋亡信号通路,启动自身抗原成分形成ABs,促进活化的表朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)识别、吞噬ABs,最终诱导特异性免疫应答发生,促进白癜风发展。方法本研究使用白癜风永生化黑素细胞系(PIG3V),利用氧化应激诱导凋亡,分离纯化ABs,透射电镜形态学鉴定ABs,流式细胞术检测微粒表面磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)的表达,进一步鉴定ABs质量,Western Blot鉴定ABs中相关抗原组分,蛋白质组学验证Western Blot结果,免疫电镜观察抗原与ABs共定位情况。观察不同氧化应激条件下ABs的形态学改变,Western Blot检测ABs中抗原再定位情况,流式细胞术检测ABs的形成情况(FSC/SSC分析),分析自身抗原表达量、ABs形成与氧化应激诱导时间、剂量是否存在正相关,探讨自身抗原、ABs形成以及氧化应激之间的关联性;在稳定的凋亡模型的基础上,利用JNK、caspase、骨架蛋白激活等激酶抑制剂预处理PIG3V细胞,Western Blot检测ABs中抗原蛋白量的变化,流式检测ABs形成的变化,观察相关信号通路激酶抑制剂对ABs形成及抗原再定位的影响,明确参与ABs形成的信号通路。结果1.选择由低到高浓度的H2O2,处理黑素细胞24h后检测细胞的凋亡情况并做统计学分析,明确造成凋亡有统计学意义而坏死无明显差异的浓度800μmol/l,成功建立黑素细胞凋亡模型。2.分离纯化ABs,进行电镜形态学鉴定,进一步流式鉴定表面PS表达明确90%以上被检颗粒为Annexin V阳性,提示我们成功分离纯化了ABs。3.选取已经明确的白癜风相关抗原蛋白抗体TYR,TYRP-1,TYRP-2及我们课题组前期发现的Lamin A及Lamin A(ASP230)等进行ABs总蛋白的Western Blot实验,明确了Lamin A(ASP230),TYRP-1在凋亡过程中可再定位于ABs。进一步研究明确胞质及核内自身免疫性相关抗原蛋白也可在凋亡过程中再定位于ABs。蛋白质组学证实了Western Blot结果。免疫电镜的方法观察到了阳性抗原与ABs存在共定位。4.对黑素细胞进行不同强度及不同时间的氧化应激刺激,电镜形态学鉴定ABs,发现随着刺激浓度增加,ABs形态无明显改变,但接近坏死浓度时,ABs较少,大部分为坏死细胞碎片。进一步观察不同时间ABs变化,发现随着刺激时间的延长,ABs逐渐肿胀,破碎。5.对黑素细胞进行不同强度及不同时间的氧化应激刺激,Western Blot发现ABs中阳性抗原蛋白与氧化应激刺激强度及时间呈正相关。进一步流式细胞术检测ABs形成情况,发现ABs形成与氧化应激刺激强度和时间呈正相关。6.利用JNK抑制剂SP600125、caspase抑制剂Z-VAD、骨架蛋白激活激酶抑制剂Y-27632及ML-9预处理细胞后诱导凋亡,分离纯化ABs,Western Blot检测发现抑制相关信号通路可以抑制阳性抗原再定位于ABs,流式检测ABs的形成,发现抑制相关信号通路可以抑制ABs的形成,以上结果提示:JNK、caspase、骨架蛋白激活相关信号通路参与抗原再定位及ABs形成。结论本研究成功分离纯化了PIG3V细胞来源的ABs,鉴定明确ABs含有Lamin A(ASP230)、TYRP-1等白癜风相关抗原蛋白,JNK、caspase、骨架蛋白激活等信号通路参与ABs形成及抗原再定位。综合文献及我们研究结果提示,氧化应激通过激活JNK信号通路启动caspase级联反应诱导凋亡,白癜风相关抗原参与形成ABs。高强度及长时间氧化应激条件下ABs膜完整性受损,抗原蛋白可由ABs释放至膜外,提示ABs可能为胞内抗原直接外泄的途径。综上所述,本研究首次明确了在氧化应激诱导黑素细胞凋亡后自身抗原变形凝集于ABs,胞内抗原暴露,为特异性CTL克隆及活化自反应性B细胞提供了可能的抗原来源,为氧化应激启动自身免疫反应的机制提供了新证据,对于进一步丰富和完善白癜风的发病机制提供了重要的理论依据。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R758.41
【部分图文】：

图 1 遗传、环境与免疫因素共同作用导致白癜风发病化应激启动黑素细胞凋亡癜风氧化-抗氧化失衡究表明在白癜风发病早期，外源性持续氧化应激因子是诱发白斑的重VB、酚类接触物、外伤等，这也与临床上白癜风常见于面颈、肢端等致[22]。诸多证据表明白癜风患者血清或表皮局部微环境中存在着氧化衡紊乱。首先在患者皮损局部发现了 H2O2过量蓄积，浓度高达 103/如丙二醛也明显升高[23-25]。 总抗氧化状态及抗氧化物谷胱甘肽过氧氢酶等抗氧化酶活性也明显下降[26,27]。另外，白癜风患者红细胞中脂及超氧化物歧化酶活性显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶活性、谷胱甘低，黄嘌呤氧化酶活性、血浆丙二醛（Malondialdehyde ，MDA）也常情况下表皮黑素细胞在合成黑素小体的过程中会导致胞浆内过量

4 目前尚存在的问题前期研究结果和文献支持，氧化应激和自身免疫共同参与了白癜风的发病，凋亡后所启动的自身免疫应答可能是白癜风急速发展、进一步恶化的主要原因。细胞、体液免疫应答是黑素细胞破坏的主要效应环节，特异性免疫应答所识别黑素细胞抗原已明确，但胞内自身抗原暴露、识别、吞噬的分子机制尚不明确。这些自身抗原如何暴露，如何被表皮 LC 细胞吞噬、呈递，如何启动细胞免疫及体液免疫应答，自然成为我们下一步关注的重点。我们推测，黑素细胞凋亡清除机制异常，胞内自身抗原释放，是抗原暴露、抗原呈递的重要效应环节。结合大量文献及前期研究结果，我们提出本课题研究假说（图 2）：在黑素细胞的凋亡过程中，氧化应激通过激活 JNK、caspase 等凋亡信号通路、剪切 Lamin A等凋亡途径，促进自身抗原形成 ABs，晚期凋亡黑素细胞释放出危险信号 DangerSignals ，促进活化表皮 LC 细胞识别、吞噬 ABs，诱导特异性免疫应答。

图 3 不同浓度 H2O2刺激 PIG3V 凋亡分析细胞刺激 24h 后染 Annexin V 和 PI，由流式细胞仪检测凋亡，可见凋亡及坏随着刺激浓度升高而逐渐升高。1.2 统计筛选刺激浓度我们发现由于 PIG3V 细胞本身作为一种受损细胞，其刺激浓度过高，会对后验造成影响，ABs 的释放在早期凋亡和晚期凋亡中都是存在的，并且其发生晚 外翻，因此，通过统计学分析（图 4），综合实验结果及相关文献，我们选择有统计学差异而坏死无统计学差异的刺激浓度做为实验浓度(800μmol/L)。
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本文编号：2892028