CRISPR/Cas9介导皮肤致敏评价细胞模型EndoSens的建立与评估研究
发布时间：2021-06-22 00:49
皮肤致敏性测试是化妆品原料和产品安全性评价的重要内容。随着国际社会对实验动物福利伦理和3R原则日益重视和不断推行,以及欧盟等国家相继对化妆品成分和产品禁止动物试验后,化妆品安全性评价体外替代方法研究成为国际发展趋势和研究热点。基于皮肤致敏有害结局通路的关键事件,开发模拟体内致敏过程的模型,是目前国内外体外替代方法研发的基本策略。在致敏物角质细胞激活水平,基于Keap1-Nrf2抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element,ARE）荧光素酶报告模型(KeratinoSensTM和LuSens)均能在体外反映化合物皮肤致敏特性。但以上细胞模型均为随机插入的转基因荧光素酶报告细胞模型,实为间接评估皮肤致敏基因的表达,大量基因拷贝的转入也影响致敏评估结果的准确性。随着CRISPR/Cas9介导精准基因编辑技术的发展,可将荧光素酶报告基因定点整合到内源靶基因表达框内,达到真正实时同步报告内源靶基因的表达,从而更加准确地检测细胞致敏的表型。本研究应用CRISPR/Cas9和同源重组介导的精准基因编辑技术,成功建立了荧光素酶基因敲入的HMOX1实时报...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
直接多肽反应测试方法
第一章 绪论硫醇类蛋白质加合物进行荧光检测，可大幅缩短检测时间（图 1-5）。Avonto 等通过测试 28 种皮肤致敏物和 8 种非致敏物来评估 HTS-DCYA 的预测性能，该方法的准确度灵敏度和特异性分别为 82％，79％和 90％。在同一测试数据集下 DPRA 的准确性，敏感性和特异性分别为 92％，100％和 80％[32]。此外，Avonto 等还尝试应用 HTS-DCYA方法对植物 取物进行致敏性检测，展现出了一定的复杂组分致敏性预测能力[41,42]。
U6-sgRNA 重组表达载体构建1）根据 HMOX1 的基因组序列，本研究选择其第 5 外显子的终止密码子进行 sgRNA 设计（http://crispr.mit.edu/），最终优选了 3 个特异性较强的点，sgRNA 设计结果如图 2-6 所示：图 2-6 sgRNA 设计示意图Figure 2-6 Schematic of sgRNA design2）以 HaCaT 细胞进行基因组为模板对 sgRNA 打靶位点进行 PCR 扩增 Sanger 测序，通过序列比对，结果如图 2-6 所示，待打靶序列与 NCBI 1 基因参考序列一致。sgRNA1
本文编号：3241774
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
直接多肽反应测试方法
第一章 绪论硫醇类蛋白质加合物进行荧光检测，可大幅缩短检测时间（图 1-5）。Avonto 等通过测试 28 种皮肤致敏物和 8 种非致敏物来评估 HTS-DCYA 的预测性能，该方法的准确度灵敏度和特异性分别为 82％，79％和 90％。在同一测试数据集下 DPRA 的准确性，敏感性和特异性分别为 92％，100％和 80％[32]。此外，Avonto 等还尝试应用 HTS-DCYA方法对植物 取物进行致敏性检测，展现出了一定的复杂组分致敏性预测能力[41,42]。
U6-sgRNA 重组表达载体构建1）根据 HMOX1 的基因组序列，本研究选择其第 5 外显子的终止密码子进行 sgRNA 设计（http://crispr.mit.edu/），最终优选了 3 个特异性较强的点，sgRNA 设计结果如图 2-6 所示：图 2-6 sgRNA 设计示意图Figure 2-6 Schematic of sgRNA design2）以 HaCaT 细胞进行基因组为模板对 sgRNA 打靶位点进行 PCR 扩增 Sanger 测序，通过序列比对，结果如图 2-6 所示，待打靶序列与 NCBI 1 基因参考序列一致。sgRNA1
本文编号：3241774
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/pifb/3241774.html
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