瘦素对角质形成细胞增殖分化角蛋白的影响及其分子信号通路的研究

发布时间：2017-05-26 11:30

  本文关键词：瘦素对角质形成细胞增殖分化角蛋白的影响及其分子信号通路的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：银屑病是临床上常见的慢性炎症性皮肤病，由T细胞（Th细胞）协同角质形成细胞（Keratinocyte, KC）过度增殖性为特征，其发病机制目前尚未完全阐明，可能是由一系列因素相互作用的多基因遗传疾病，包括遗传因素、免疫因素、环境因素、肥胖等。 近来临床观察研究发现，银屑病伴发肥胖的比例增高，针对肥胖治疗后有助于银屑病好转，提示肥胖与银屑病密切相关。瘦素是参与机体代谢的脂肪因子，以往研究表明瘦素与其受体在银屑病皮损中高表达，瘦素可能与银屑病的表皮过度增殖相关，，提示瘦素可能为银屑病与肥胖的内在重要分子联系。 在正常皮肤中，KC分化相关性角蛋白K1和K10占主导地位，增殖相关性角蛋白K16和K17几乎不表达或者少量表达，而在银屑病皮损中，KC角蛋白谱发生一定的改变，K16和K17在皮损处高表达，且与PASI呈正相关关系，而K1和K10则低表达。 我们前期研究发现，瘦素在银屑病患者皮损中过度表达，且瘦素对KC活性及细胞周期、细胞增殖均产生影响，并能刺激KC产生银屑病相关炎症因子，包括IL-6、IL-8、TNF-α等，以上研究结果表明瘦素参与了银屑病表皮过度增殖的病理生理过程，但瘦素在银屑病病理生理过程中的作用尚不明确。 目的 本研究的目的在于通过观察瘦素对KC角蛋白（K1、K10，K16、K17）表达的影响及其分子调控为进一步阐明瘦素影响KC增殖在银屑病发病机制中奠定基础。 方法 体外培养HaCaT细胞，用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、蛋白质免疫印迹法（Western blot）和细胞免疫荧光染色分别检测K1、K10、K16、K17mRNA和蛋白水平的表达，采用Western blot筛选瘦素处理后可能出现的信号通路分子改变，并用相应的通路抑制剂和siRNA处理证实瘦素调控角蛋白表达的信号通路。 结果 1、瘦素对HaCaT细胞增殖分化角蛋白表达的影响：1）mRNA结果：与阴性对照组比较，瘦素组K1、K10mRNA表达量下调，K16、K17mRNA均出现不同程度的升高，差异具有统计学意义（P 0.05），且浓度为100ng/mL瘦素组K16、K17mRNA上调显著；2）蛋白结果：与阴性对照组相比较，瘦素组K1、K10蛋白表达量降低，K16、K17蛋白均出现不同程度的升高，且浓度为100ng/mL瘦素组K16、K17蛋白显著增加；3）免疫荧光结果：瘦素组红色荧光K16、K17表达与阴性对照组相比显著增加，而K1、K10红色荧光表达明显降低，与RT-PCR、Western blot结果相符。 2、瘦素调控HaCaT细胞分子信号通路：用100ng/mL瘦素分别刺激HaCaT细胞5min、10min、20min、40min、80min，发现瘦素可以激活JAK-STAT3、ERK1/2分子信号通路。 3、分子信号通路抑制剂对瘦素调控HaCaT细胞增殖分化角蛋白的影响：1）mRNA结果：与单纯使用瘦素组相比较，抑制剂和瘦素联合处理组K1、K10、K16、K17mRNA显著下降，差异具有统计学意义（P 0.05）；2）蛋白结果：与单纯使用瘦素组相比较，抑制剂和瘦素联合处理组K1、K10、K16、K17蛋白显著降低；3）免疫荧光结果：抑制剂和瘦素联合处理组K1、K10、K16、K17表达的红色荧光较瘦素组明显减弱，与RT-PCR、Western blot结果相符。 4.、进一步验证分子信号通路siRNA对瘦素调控HaCaT细胞增殖角蛋白的影响：1）mRNA结果：siRNA和瘦素联合处理组与单纯使用瘦素组相比较K16、K17mRNA显著下降，差异具有统计学意义（P 0.01）；2）蛋白结果：siRNA成功阻断STAT3、ERK1/2分子通路，且K16、K17蛋白明显低于瘦素组。 结论 本研究证明瘦素可以诱导HaCaT细胞高表达K16、K17，低表达K1、K10，其机制可能与STAT3、ERK1/2分子信号通路有关，表明瘦素可影响银屑病角质形成细胞的增殖，抑制角质形成细胞的分化，提示瘦素可能通过改变KC增殖分化角蛋白的水平参与肥胖银屑病的发生发展。
【关键词】：银屑病 肥胖 瘦素 角蛋白 STAT3 ERK1/2
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-25
• 一、银屑病14-17
• 二、瘦素17-22
• 三、瘦素与银屑病22-25
• 1 材料与仪器25-30
• 2 实验方法30-42
• 2.1 HaCaT 细胞培养30
• 2.2 RT- PCR 检测不同浓度的瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 mRNA 表达的影响30-33
• 2.3 蛋白免疫印记法检测不同浓度的瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响33-35
• 2.4 RT-PCR 检测 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 mRNA 表达的影响35-36
• 2.5 蛋白免疫印迹法检测 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响36
• 2.6 细胞免疫荧光染色检测 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响36-37
• 2.7 蛋白免疫印迹法检测瘦素对 HaCaT 细胞的分子信号通路的影响37-38
• 2.8 RT-PCR 检测分子信号通路抑制剂对瘦素调控 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 mRNA 表达的影响38-39
• 2.9 蛋白免疫印迹法检测分子信号通路抑制剂对瘦素调控 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响39-40
• 2.10 细胞免疫荧光染色检测分子信号通路抑制剂对瘦素调控 HaCaT 细胞K1、K10、K16、K17 表达的影响40
• 2.11 RT-PCR 检测分子信号通路阻断剂对瘦素调控 HaCaT 细胞 K16、K17 mRNA 表达的影响40-41
• 2.12 蛋白免疫印迹法检测信号通路阻断剂对瘦素调控 HaCaT 细胞 K16、K17 蛋白表达的影响41-42
• 2.13 统计学分析42
• 3 结果42-51
• 3.1 不同浓度的瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 mRNA 表达的影响42
• 3.2 不同浓度的瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响42-43
• 3.3 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17mRNA 及蛋白表达影响43-45
• 3.4 细胞免疫荧光测 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17蛋白表达的影响45-46
• 3.5 100ng/mL 瘦素对 HaCaT 细胞分子信号通路蛋白的影响46-47
• 3.6 STAT3 抑制剂和 ERK1/2 抑制剂对瘦素刺激 HaCaT 细胞 K1、K10、K16、K17 mRNA 表达的影响47-48
• 3.7 STAT3 抑制剂和 ERK1/2 抑制剂对瘦素刺激 HaCaT 细胞表达 K1、K10、K16、K17 蛋白的影响48-49
• 3.8 细胞免疫荧光测 STAT3 抑制剂和 ERK1/2 抑制剂对瘦素刺激 HaCaT 细胞K1、K10、K16、K17 蛋白表达的影响49
• 3.9 STAT3 阻断剂和 ERK1/2 阻断剂对瘦素刺激 HaCaT 细胞 K16、K17 mRNA 表达的影响49-50
• 3.10 STAT3 阻断剂和 ERK1/2 阻断剂对瘦素刺激 HaCaT 细胞 K16、K17 蛋白表达的影响50-51
• 4 讨论51-57
• 小结57-58
• 参考文献58-68
• 个人简历和研究成果68-69
• 致谢69

【共引文献】

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  本文关键词：瘦素对角质形成细胞增殖分化角蛋白的影响及其分子信号通路的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：396704