XPA在黑素瘤细胞顺铂耐药中的作用及机制研究
发布时间：2017-08-26 23:33
本文关键词：XPA在黑素瘤细胞顺铂耐药中的作用及机制研究
【摘要】：背景:黑素瘤是起源于表皮黑素细胞的恶性肿瘤,其致死率高、治疗困难。除了早期切除外,目前针对中晚期黑素瘤尚无有效的治疗方法。作为经典的化疗药物,顺铂与其他化疗药物或免疫、靶向药物联合可增加临床治疗的有效率,特别是对一线治疗后无效、进展以及复发的患者,顺铂治疗仍具有重要作用。然而肿瘤细胞化疗耐药的发生极大的限制了顺铂等铂类药物的临床应用,因此深入探讨黑素瘤细胞顺铂耐药的机制对黑素瘤患者,特别是中晚期患者的治疗尤为重要。顺铂可与DNA形成链内及链间加合物抑制细胞复制及转录,并最终导致细胞凋亡。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)可修复受损DNA,抑制凋亡发生,是肿瘤细胞顺铂耐药的主要原因。作为NER中的关键分子,着色性干皮病A组(Xeroderma pigmentosum group A,XPA)蛋白具有识别损伤、稳定修复结构及招募下游修复蛋白的多种作用。既往在鼻咽癌、肺腺癌、前列腺癌等癌症的研究中发现,XPA高表达是肿瘤细胞顺铂耐药的重要原因。然而XPA是否参与黑素瘤顺铂耐药,目前尚未阐明。自噬是细胞内重要的生理过程,其通过降解并再利用细胞内变性、受损及失去功能的细胞器及蛋白等成分维持内环境稳态并为细胞提供必要的营养成分。大量研究表明化疗药物作用于肿瘤细胞后,细胞内自噬水平增加并可导致耐药发生。然而肿瘤细胞内调控自噬应对化疗打击的机制目前尚未完全阐明。研究表明,针对DNA损伤的修复过程常会消耗大量能量,而自噬恰恰具有能量供给功能,提示损伤修复可能是化疗药物治疗后自噬激活的关键环节。此外,已有研究证实化疗药物作用后,一些dna修复分子可直接参与激活细胞内自噬水平。最新的一项研究发现,xpa缺陷细胞内存在线粒体自噬障碍,提示xpa可能参与细胞内自噬的调控。基于以上研究发现,我们提出以下科学假说:顺铂作用于黑素瘤细胞后,ner通路活化促进dna损伤修复并介导自噬激活,造成肿瘤细胞顺铂耐药。xpa作为ner修复中的重要分子,可能在该过程中发挥关键的调控作用。目的:1.分析并验证xpa表达水平与黑素瘤细胞顺铂耐药的相关性;2.阐明xpa参与黑素瘤细胞顺铂耐药的分子机制。方法:1.利用qrt-pcr技术对黑素细胞及黑素瘤细胞xpamrna水平进行检测;同时,利用细胞增殖与毒性检测试剂盒(cellcountingkit-8assay,cck8)对顺铂处理后黑素细胞及黑素瘤细胞活性进行检测并对顺铂ic50值进行计算;明确二者的相关性;2.干涉xpa表达,利用cck8检测xpa干涉对黑素瘤细胞顺铂耐药的影响;利用westernblot、流式技术检测xpa干涉对顺铂诱导细胞凋亡的影响;3.分别利用westernblot、电镜、免疫荧光技术检测顺铂处理对黑素瘤细胞自噬水平的影响;4.干涉xpa表达,利用westernblot、免疫荧光技术检测xpa干涉对顺铂诱导自噬的影响;5.干涉xpa表达,利用westernblot技术检测xpa干涉对parp1活化的影响;6.干涉parp1表达或应用parp1抑制剂,利用westernblot、免疫荧光技术检测parp1干涉及活性抑制对顺铂诱导自噬的影响;7.干涉parp1表达,利用westernblot技术检测parp1干涉对mtor活化、hmgb1出核及表达的影响;8.干涉atg12或parp1表达,利用克隆形成技术检测atg12或parp1干涉对顺铂诱导细胞毒性的影响;结果:1.与黑素细胞系相比,不同黑素瘤细胞系中XPA表达水平均升高且与顺铂耐药水平呈正相关;选取XPA高表达且耐药性高的Hs294T、A2058两株细胞系为研究对象进行后续实验;2.CCK8结果显示:干涉XPA表达可增加黑素瘤细胞顺铂敏感性;3.Western blot及流式结果显示:干涉XPA表达可增加顺铂诱导的Caspase3活化及细胞凋亡的发生;4.Western blot、电镜、免疫荧光结果显示:顺铂处理后黑素瘤细胞内自噬水平增加;5.Western blot及免疫荧光结果显示:干涉XPA表达可抑制顺铂诱导的自噬水平增加;5.Western blot结果显示:干涉XPA表达可抑制顺铂诱导的PARP1活化;6.Western blot、免疫荧光结果显示:干涉PARP1表达或抑制PARP1活性可抑制顺铂诱导的自噬水平增加;7.Western blot结果显示:干涉PARP1表达可抑制顺铂诱导的HMGB1表达增加及出核;8.克隆形成实验结果显示:干涉ATG12或PARP1表达可增加黑素细胞顺铂敏感性,且干涉PARP1的治疗效果优于干涉ATG12。结论:通过本课题的研究,我们首次发现黑素瘤细胞中顺铂处理后XPA可通过活化PARP1促进细胞内自噬水平升高。这一机制与XPA介导的NER修复共同促进黑素瘤细胞顺铂耐药的发生。我们的发现加深了对黑素瘤顺铂耐药机制的认识,也为黑素瘤化疗联合治疗提供了新的靶点。
【关键词】：黑素瘤 顺铂 XPA 自噬 PARP1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：
- 缩略语表5-8
- 中文摘要8-11
- ABSTRACT11-15
- 前言15-17
- 文献回顾17-29
- 1. 黑素瘤及顺铂治疗17-18
- 1.1 顺铂的药理作用机制17
- 1.2 顺铂在黑素瘤中的治疗现状17-18
- 2. 细胞对顺铂耐药的机制18-20
- 2.1 DNA损伤修复18-19
- 2.2 药物运输19
- 2.3 凋亡抵抗19
- 2.4 细胞自噬19-20
- 3. XPA20-24
- 3.1 XPA的结构20-21
- 3.2 XPA的转录后修饰21-22
- 3.3 XPA的生理功能22-24
- 4. PARP124-29
- 4.1 PARP1的结构与酶活性24
- 4.2 PARP1的生理功能24-29
- 1 材料29-41
- 1.1 主要仪器设备29-30
- 1.2 主要实验试剂30-33
- 1.3 其它材料33-35
- 1.4 实验溶液配方35-41
- 2 方法41-57
- 2.1 XPA与黑素瘤细胞顺铂耐药的相关性分析及验证41-52
- 2.2 XPA参与黑素瘤细胞顺铂耐药的机制研究52-57
- 3 结果57-76
- 3.1 XPA与黑素瘤细胞顺铂耐药的相关性分析及验证57-63
- 3.2 XPA参与黑素瘤细胞顺铂耐药的机制研究63-76
- 4 讨论76-83
- 小结83-84
- 参考文献84-94
- 个人简历和研究成果94-96
- 致谢96
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本文编号：743252
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