EPCs示踪胶质瘤及对其生长影响的MRI研究

发布时间：2017-11-11 16:19

  本文关键词：EPCs示踪胶质瘤及对其生长影响的MRI研究

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【摘要】：背景:内皮祖细胞(EPCs)起源于中胚层的成血管细胞,出生后主要存在于骨髓内。Asahara等在1997年从外周血中分离出了内皮祖细胞,目前被广泛接受的是表达CD34+,CD133+和VEGFR-2+(也称为KDR或FLK1)的细胞为内皮祖细胞。内皮祖细胞可以用贴壁培养、免疫磁珠筛选、流式细胞仪等方法从骨髓、脐带血和外周血中分离出来,我课题组一直以来选用贴壁培养法分离大鼠脾脏起源的内皮祖细胞,并取得了较为满意的效果。恶性胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,目前公认的治疗方法是手术辅以化疗和放疗。但是由于GBM常侵犯周围组织结构,胶质瘤干细胞对放化疗耐药性高,从而造成手术切除率低、术后复发率高,GBM的中位生存时间仅为14.6个月。近年来,随着对恶性胶质瘤研究的进一步深入,某些细胞信号转导途径和相关基因在恶性胶质瘤的发生发展中所起的作用越来越明确,这也让新的治疗方法,即生物靶向治疗成为可能。近年来,很多学者设想使用某种载体携带细胞因子、自杀基因和溶瘤细胞基因治疗胶质瘤,作为生物靶向治疗的载体,最基本的要求是其可以将治疗基因特异性地带入到肿瘤细胞内并使其充分表达。EPCs可以在多种细胞因子的趋化作用下从骨髓龛动员出来,归巢至脑内胶质瘤,并分化成血管内皮细胞参与肿瘤新生血管的形成,这一特征使EPCs携带毒性基因、抗癌基因、化疗药物靶向治疗胶质瘤成为可能。但EPCs归巢后在胶质瘤内是如何分布的,是否会促进胶质瘤的生长或对其他生物学特性造成影响是EPCs作为胶质瘤靶向示踪或治疗载体需要解决的关键问题。我们的前期研究结果显示,剂量为1×106的EPCs注射入大鼠体内,CTP、MVD、肿瘤体积等指标证实EPCs不会促进胶质瘤的生长。但EPCs参与胶质瘤新生血管形成是一个复杂的过程,注入模型体内EPCs的数量、不同的观察时间点、肿瘤生长周期以及所用MRI场强等都可能会对实验结果造成一定程度的影响。为了进一步证实外源性EPCs对胶质瘤的生物学特性有无影响,本研究将较高剂量的EPCs注入胶质瘤大鼠体内,利用超高场强MRI观察USPIO-EPCs在大鼠胶质瘤内部分布的位点及迁移过程,进一步明确其示踪胶质瘤的有效性,并通过DSC-EPI、肿瘤体积及病理学相关指标评价USPIO-EPCs对胶质瘤生长和相关生物学特性是否会造成影响。最终,为EPCs作为胶质瘤靶向示踪、抗肿瘤基因或药物的细胞载体研究提供实验依据。目的:探讨uspio-epcs在大鼠原位脑胶质瘤内的动态归巢特点及可能的机制,分析epcs对肿瘤生长和相关生物学特征变化的影响,为epcs作为胶质瘤示踪、诊断和治疗载体提供有效性、可行性和安全性的实验依据。材料和方法:1.uspio-epcs示踪大鼠原位脑胶质瘤及在胶质瘤内的动态归巢超高场mri研究1.1epcs的分离、鉴定和培养采用我科方靖琴等的方法。1.2建立原位c6胶质瘤模型和分组将实验大鼠分为肿瘤组、假肿瘤组和对照组,剪开大鼠头皮,刺破颅骨和硬脑膜后,利用立体定向仪向肿瘤组和对照组注入10ulc6胶质瘤细胞,而假肿瘤组仅注射入等量dpbs,建模后第7天肿瘤组和假肿瘤组经大鼠尾静脉注入剂量为2×106的uspio-epcs,对照组仅注入等量的生理盐水。1.3uspio-epcs示踪胶质瘤mri观察采用7.0t德国布鲁克公司磁共振扫描仪biospec70/20usr机型进行扫描,扫描序列包括t1wi、t2wi、t2map和swi序列。分别在注射uspio-epcs前、注射1、3、5、7天后在每个序列上观察肿瘤内部信号变化情况。在t2map图像上测量各组病变区在不同时间点的t2值,并绘制时间—t2map值曲线。1.4移植epcs后胶质瘤的病理组织学特征观察在相同时间点对3组标本进行取材,用4%多聚甲醛和生理盐水经左心室灌注,取出脑组织后进行石蜡包埋后进行病理学分析,用普鲁士蓝染色后观察标本内是否有阳性的蓝染颗粒及其分布的区域,对普鲁士蓝染色阳性的标本进行f4/80染色,观察有无阳性表达,以鉴别蓝染的细胞是吞噬铁颗粒的巨噬细胞还是uspio-epcs。对各标本进行mmp-9、vegf、sdf-1染色等,观察标本中阳性细胞的分布情况与普鲁士蓝染色阳性细胞的分布之间是否存在联系。2.uspio-epcs对大鼠原位脑胶质瘤生长特征影响的超高场动态mri观察2.1c6胶质瘤模型的建立和分组在立体定向仪上建立大鼠胶质瘤模型后,将大鼠胶质瘤模型分为3个组,待肿瘤生长至第7天时,a组大鼠经尾静脉注射入剂量为2×106的uspio-epcs,b组大鼠注射剂量为3×106的uspio-epcs,对照组大鼠则只注射入等量的生理盐水。2.2肿瘤体积的mri形态学变化3组均在移植epcs1、3、5、7天后分别进行mri扫描,在t1wi增强序列上测量肿瘤4个时间点的最大左右径、前后径、上下径,根据公式左右径×前后径×上下径计算出肿瘤的体积,通过统计学分析3组肿瘤在相同时间点的体积差异有无统计学意义。2.3肿瘤的灌注特征分析在dsc-epi上得到3组肿瘤4个时间点的灌注图像,通过imagej6.0后处理软件测量肿瘤区域5个点相应的rcbv和mtt数值,取平均数后进行统计学分析,观察3组肿瘤相同时间点的血流灌注值有无差异。2.4肿瘤的病理组织学特征变化大鼠处死灌注取材后对肿瘤标本进行cd34+、mmp-9和vegf染色,在高倍镜下(×200)选择5个视野对cd34+染色阳性的区域进行计数,之后取平均值得到mvd,计数微血管标准是每个染色为棕黄色的细胞计数为一个血管。除此之外,在微血管密度较高的区域选用高倍视野(×200)下随机测量5个血管的最大横径,取其平均值为微血管直径。在高倍镜下(×200)在mmp-9和vegf阳性表达密集的区域进行计数,通过统计学分析3组的病理学指标在相同时间点的差异有无统计学意义。结果:1.uspio-epcs示踪大鼠原位脑胶质瘤结果及动态归巢特征1.1uspio-epcs示踪脑胶质瘤的动态mri表现假肿瘤组移植uspio-epcs前后在swi上均表现为低信号,t2map—时间曲线趋于平直,而肿瘤组在移植uspio-epcs前颅内病变在swi上呈等高信号,移植uspio-epcs1天后,肿瘤周边出现少许点状低信号,第3天后swi上肿瘤内部出现点状、蜿蜒状低信号,主要沿血管分布。移植第5天和第7天后发现肿瘤内低信号随瘤龄的增长逐渐增多,兴趣区的t2map—时间曲线呈下降趋势。对照组肿瘤体积逐渐增大,而其内信号没有明显改变。1.2uspio-epcs示踪脑胶质瘤的组织学特征肿瘤组经普鲁士蓝染色后也发现了同mri一致的现象,假肿瘤组经普鲁士蓝染色后在脑组织内仅发现零星分布的蓝染细胞,对肿瘤组和假肿瘤组各时间点的普鲁士蓝染色阳性细胞进行计数,经统计学分析后发现两组在各个时间点的差异均有统计学意义(p0.01)。由于巨噬细胞吞噬铁颗粒后在普鲁士蓝染色上也可呈阳性,我们将染色阳性的标本用f4/80染色后却未发现阳性结果,证明蓝染的细胞是uspio-epcs,而非巨噬细胞。1.3uspio-epcs示踪脑胶质瘤的免疫组化染色肿瘤组在移植uspio-epcs1天后肿瘤外周区有明显的sdf-1和mmp-9表达,而肿瘤中央区表达相对较少;7天后在肿瘤中央区及外周区均有较多的sdf-1和mmp-9染色阳性细胞分布,其分布基本与普鲁士蓝染色阳性的分布情况基本一致,而vegf染色阳性细胞仅随着瘤龄的增长逐渐增多,一直比较均匀地分布于肿瘤内部。2.磁标记的外源性epcs对大鼠原位脑胶质瘤生长影响的动态mri观察2.1不同剂量uspio-epcs对胶质瘤生长的影响移植uspio-epcs后第1、3、5、7天,3组肿瘤的体积在各个时间点的差异没有统计学意义(p0.05)。2.2不同剂量uspio-epcs对胶质瘤mri灌注的影响dsc-epi扫描后发现肿瘤区域较对侧脑组织呈明显的高灌注,各组的rcbv值随着瘤龄的增长逐渐增加,组间相同时间点的mtt和rcbv的差异没有统计学意义(p0.05)。2.3不同剂量、不同时相uspio-epcs对胶质瘤病理学特征的影响肿瘤经he染色后在镜下发现肿瘤细胞呈梭形,增长活跃,排列杂乱无序,与正常脑组织可见一较明显的边界,但在交界区可见肿瘤细胞浸润入脑组织中。vegf主要表达于肿瘤细胞胞质和胞浆内,血管内皮细胞的胞质内也可见少量表达,mmp-9大多表达于肿瘤细胞胞浆和血管基底膜上,对3组各个时间点的vegf和mmp-9阳性表达细胞进行计数,发现vegf和mmp-9的阳性表达数目在相同时间点的差异均没有统计学意义(p0.05)。肿瘤组织经cd34+免疫组化染色后发现染色阳性的微血管呈蜿蜒状或环状,形态各异大小不一,分布不均匀。我们通过对mvd计数表明,3组大鼠胶质瘤模型的相同时间点的mvd值差异并没有统计学意义(p0.05),3个组的mvd和rcbv值存在正相关。3组肿瘤生长到第14天的微血管直径为17.25—24.38μm,统计学分析发现微血管直径在3组的差异也没有统计学意义(p0.05)。结论1、uspio标记的epcs可以向大鼠胶质瘤区域归巢,并可以被mri所检测,7.0t超高场mri清晰的显示epcs早期主要分布在胶质瘤外周区域,随着瘤龄的增长逐渐迁移到肿瘤中心区域。肿瘤组织不同区域sdf-1和mmp-9表达变化与uspio标记的EPCs在肿瘤内的分布变化有明显的相关性,表明SDF-1和MMP-9在肿瘤内部表达分布变化情况可能是促使外源性EPCs由肿瘤周边向肿瘤中央区域迁移的分子生物学机制之一。2、建立大鼠原位脑胶质瘤需刺破脑组织,创伤也可导致EPCs向病变区域归巢。我们通过建立假肿瘤组,将归巢的EPCs的数目与肿瘤组的进行对比,发现肿瘤组归巢的EPCs数目明显多于假肿瘤组,证明EPCs主要归巢至脑胶质瘤。同时,用F4/80染色普鲁士蓝阳性细胞,并未发现明显阳性表达,进一步证明实验中普鲁士蓝染色阳性的是吞噬了铁磁颗粒的内皮祖细胞而非巨噬细胞。3、外源性的EPCs注入大鼠体内,数量为2×106和3×106在一定时间内不会促进C6胶质瘤的生长,也不会导致其他生物学特性如肿瘤血管灌注特征、微血管密度、微血管管径以及VEGF和MMP-9等细胞因子的变化。研究结果也进一步说明USPIO-EPCs是作为胶质瘤示踪或治疗载体在一定时间内、一定剂量范围内是安全的、有效的。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41;R445.2

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