突触囊泡蛋白2A在颞叶癫痫海马区星形胶质细胞上的表达及功能研究

发布时间：2017-12-19 07:46

  本文关键词：突触囊泡蛋白2A在颞叶癫痫海马区星形胶质细胞上的表达及功能研究

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【摘要】：背景颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是目前成人最常见的药物难治性癫痫,发病机制不清。致痫灶内反应性星型胶质胶质细胞增生、肥大可能参与了颞叶癫痫发生过程,深入研究致痫灶内星型胶质细胞功能可能为癫痫治疗带来的策略。星形胶质细胞通过释放胶质递质可同步调节大量神经元活动,类似于神经递质的量子化释放,囊泡介导的胞吐过程是胶质递质释放的重要途径,需要一系列分泌相关蛋白的参与。突触囊泡蛋白2A(synaptic vesicle protein 2A,SV2A)是脑内突触传递的重要正向调节蛋白,在囊泡胞吐和维持Ca2+稳态方面发挥重要作用,目前研究发现新型抗癫痫药物左乙拉西坦有可能通过SV2A介导抗癫痫作用,提示SV2A在癫痫发生过程中扮演重要角色,前期我课题组预实验发现星型胶质细胞在病理状态下表达SV2A,藉此我们提出假设:反应性星型胶质细胞表达SV2A促进了局部神经回路兴奋性增高,继而介导慢性颞叶癫痫的形成。目的观察SV2A在颞叶癫痫病人和动物模型海马中的表达特征,以及在星型胶质细胞上的表达特点和超微结构,进而在离体水平探讨SV2A参与活化状态星形胶质细胞的促兴奋机制。方法免疫组化染色观察SV2A在颞叶癫痫患者海马区和颞叶皮质中的表达变化。建立大鼠锂-匹罗卡品模型,比较SE后24h、1w、4w、8w SV2A在海马各区的分布特点及其m RNA和蛋白水平的变化。免疫荧光双标检测颞叶癫痫患者及动物模型SE后上述时点海马星形胶质细胞上SV2A的表达特点,并通过免疫电镜对SE后4w星形胶质细胞上的SV2A进行超微结构观察。LPS干预原代培养的星形胶质细胞以模拟其在硬化海马时的变化,于24h和48h后检测SV2A的蛋白表达及分布;单独给予星形胶质细胞胞内Ca2+动员剂ATP或联合LPS干预后12h、24h观察SV2A蛋白表达的变化;利用si-RNA干扰技术降低SV2A的表达后观察Ca2+感受器突触结合蛋白4(synaptotagmin4,Syt-4)m RNA的变化,以及LPS和LPS+ATP干预后Syt-4与SV2A m RNA水平的变化趋势。结果(1)TLE-HS患者海马区及颞叶皮质中阳性表达的SV2A明显少于对照组(P0.05)。动物模型急性期(SE后24h)、潜伏期(SE后1w)、慢性期早期(SE后4w)海马区SV2A m RNA和蛋白水平均低于对照组(P0.05);免疫组化显示SE后1w、4w时SV2A在CA3区透明层和DG门区的分布明显下降(P0.05)。(2)TLE-HS患者海马区AST上SV2A的阳性表达率明显高于对照组(P0.05)。大鼠对照组及SE后24h海马AST上均未检测出SV2A的表达,而SE后1w时部分AST上已出现SV2A的表达,至SE后4w、8w时可见增生肥大的AST,硬化海马各区AST上均有SV2A的阳性表达;免疫电镜示对照组AST上极少出现SV2A的表达,但SE后4w硬化海马AST的胞浆及胶质丝上均有SV2A标记的银染颗粒。(3)LPS活化AST 24h、48h后SV2A蛋白表达明显增高(P0.05),免疫荧光显示AST胞浆及突起上均有SV2A的广泛分布;单独给予ATP干预不影响SV2A的蛋白表达,但联合LPS刺激24h后SV2A的蛋白表达明显升高(P0.05)。si RNA干扰AST SV2A的表达可降低Syt-4 m RNA水平(P0.05);LPS单独或联合ATP干预后6h、12h、24h Syt-4与SV2A m RNA水平呈现一致性升高趋势。结论TLE患者海马和颞叶皮质标本中SV2A的表达降低,动物模型SE后各时点海马区同样发现了上述变化;SV2A的这种表达变化可能与SE后神经元凋亡和正常突触联系受损有关。人脑标本和动物模型慢性期硬化海马的AST上SV2A的表达异常增多,提示AST上的SV2A可能参与了癫痫发生的机制。ATP可升高活化状态下AST上SV2A的表达;AST中SV2A的变化影响了Ca2+依赖性谷氨酸释放通路关键分子Syt-4的表达。提示病理条件下AST中异常升高的SV2A可能通过调控Syt-4影响Ca2+依赖性谷氨酸递质的释放,进而参与癫痫发生中突触重塑的过程。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1

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本文编号：1307404