肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用及相关机制研究

发布时间：2018-01-27 23:38

本文关键词： 脑缺血炎症肉桂醛神经保护 TLR4 TRAF6 NF-κB　出处：《河北医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型,在世界范围内,是成人死亡的第三大原因,致残的首位原因。其高发病率、高病死率、高致残率、高复发率、恢复缓慢的特点,给社会和家庭带来沉重的负担。目前,静脉溶栓被认为是唯一有效而可行的卒中治疗措施,但是由于其严格的治疗时间窗以及颅内出血的风险,从此项治疗中获益的患者十分有限。因此,为脑卒中治疗寻找新的方案就显得尤为重要。缺血后继发性脑损伤是患者的病情加重和影响预后的重要原因,导致继发性脑损伤的病理机制主要包括炎症反应、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、凋亡等,这几种因素之间相互作用,构成复杂的调控网络,从而形成恶性循环,导致一系列病理级联反应,其中过度炎症反应存在于脑缺血后的坏死和缺血区域,是加重继发性脑损伤的主要原因之一,因此抗炎症损伤成为治疗缺血性脑血管病的重要途径之一。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)/核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路在促进炎症反应中发挥重要作用,激活TLRs能够诱导下游转录因子NF-κB的激活,并诱导炎症相关分子和细胞因子的基因转录。也有大量研究证实,TLRs和NF-κB是脑缺血后继发炎症损伤中的关键分子。肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumour-necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6),作为TLRs介导信号通路下游的重要配体分子,介导了下游NF-κB的激活。因此,TLRs和下游的信号分子是缺血性脑血管病抗炎治疗的关键靶点。肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)是樟科植物肉桂的干皮及树皮经水蒸气蒸馏得到的挥发油(肉桂油)中的主要成分,研究表明CA具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗凋亡、抗病毒、抗细菌、抗突变等多种生物学作用,并且毒副作用低,已经作为食用香料被广泛而安全的应用于饮料,冰激凌,糖果,口香糖等食品中,具有良好的临床应用潜力。在离体细胞研究中发现肉桂醛能够抑制脂多糖诱导的Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)受体及下游TRAF6及NF-κB的表达增高,而最近在大鼠心肌缺血再灌注模型中也发现肉桂醛抑制TLR4内源性配体人高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的表达,从而保护缺血受损心肌细胞。本研究选用雄性CD-1小鼠为研究对象,应用改良Longa线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)模型。在小鼠永久性大脑中动脉闭塞所致的局灶性脑缺血模型中应用肉桂醛进行干预,通过对脑梗死体积、脑组织含水量及神经功能缺损评估,观察肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用;通过对脑组织炎症介质释放,中性粒细胞浸润程度测定,观察局灶性脑缺血后肉桂醛的抗炎症损伤作用;通过对TLR4/TRAF6/NF-κB通路相关因子表达的测定,观察肉桂醛对TLR4/TRAF6/NF-κB促炎信号通路的影响,探讨局灶性脑缺血后肉桂醛抗炎及脑保护作用可能的机制。本研究分为三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用目的:观察小鼠局灶性脑缺血后神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积。研究肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用。方法:选用成年雄性CD-1小鼠、采用改良线栓法制备大脑中动脉闭塞模型。在大脑中动脉闭塞的24 h和72 h后,通过Bederson法评价神经功能缺损,干湿重法测定脑组织含水量,2%2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法测定脑梗死体积,观察肉桂醛的神经保护作用。随机将CD-1小鼠分为7组:假手术组(Sham+生理盐水,Sham+0.2%DMSO):小鼠假手术后腹腔注射等量生理盐水或者0.2%DMSO;大脑中动脉闭塞组(MCAO+生理盐水,MCAO+0.2%DMSO):小鼠大脑中动脉闭塞后即刻腹腔注射等量生理盐水或者0.2%DMSO;肉桂醛低剂量组(CA25组):小鼠大脑中动脉闭塞后即刻腹腔注射肉桂醛25 mg/kg;肉桂醛中剂量组(CA50组):小鼠大脑中动脉闭塞后即刻腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;肉桂醛高剂量组(CA75组):小鼠大脑中动脉闭塞后即刻腹腔注射肉桂醛75mg/kg。通过预实验,我们在假手术组和大脑中动脉闭塞组中发现小鼠给予等量生理盐水或者0.2%DMSO,两者神经功能缺损评分,脑组织含水量,脑梗死体积测定是没有统计学差异的,因此,我们除外了溶剂,即0.2%DMSO的生物学效应。最终共有5组:Sham组(小鼠假手术后腹腔注射0.2%DMSO),MCAO组(小鼠大脑中动脉闭塞后腹腔注射0.2%DMSO),CA25组,CA50组和CA75组被纳入接下来的试验。为了更进一步评价肉桂醛的脑保护作用,我们观察了肉桂醛不同时间点给药对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用。分别在缺血前1 h,缺血后即刻、4 h及8 h,腹腔注射肉桂醛50 mg/kg,在缺血后24 h观察小鼠的神经功能缺损评分,脑梗死体积,从而评价肉桂醛于不同时间点给药对脑缺血小鼠的脑保护作用。结果1 Sham组无神经功能缺损,神经功能缺损评分为0分;MCAO组在24 h和72 h神经功能缺损评分均较严重;CA25组在24 h和72 h与MCAO组相比神经功能缺损评分没有明显降低,差异无统计学意义(P0.05),CA50组和CA75组在24 h和72 h与MCAO组相比神经功能缺损评分明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2 CA25组的脑组织含水量在24 h和72 h与MCAO组相比均没有明显降低,差异无统计学意义(P0.05),CA50组和CA75组的脑组织含水量在24 h和72 h与MCAO组相比均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3 CA25组的脑梗死体积在24 h和72 h与MCAO组相比均没有显著降低,差异无统计学意义(P0.05),CA50和CA75组的脑梗死体积在24 h和72 h分别与MCAO组相比均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。据此,我们从神经功能缺损评分,脑水肿,脑梗死体积三方面观察,发现肉桂醛以高剂量(75 mg/kg)和中剂量(50mg/kg)给药时可以发挥较好的治疗效果,因此,后续的研究主要集中在肉桂醛的中剂量(50 mg/kg)。4于缺血前1小时,缺血后后即刻和4小时腹腔给予肉桂醛(50mg/kg),神经功能缺损评分和梗死体积较MCAO组明显下降,差异具有统计学意义(P0.05),而在缺血后8小时给予肉桂醛,神经功能缺损评分和梗死体积和MCAO组相比无明显降低,差异无统计学意义(P0.05)。结论:缺血后即刻腹腔注射肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠具有脑保护作用,能够改善脑缺血损伤后的神经功能缺损,减轻脑组织含水量并减小脑梗死体积。不仅如此,肉桂醛于缺血前1小时,缺血后4小时给药仍然具有脑保护作用。第二部分肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠的抗炎作用目的:通过对脑组织炎症介质释放,中性粒细胞浸润程度测定,观察局灶性脑缺血后肉桂醛的抗炎症损伤作用。方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,采用改良Longa线栓法制备大脑中动脉闭塞模型。随机将CD-1小鼠分为3组:假手术组(Sham组),假手术后腹腔注射0.2%DMSO;大脑中动脉闭塞组(MCAO组),小鼠大脑中动脉闭塞后腹腔注射等量0.2%DMSO;肉桂醛中剂量组(CA50组),小鼠大脑中动脉闭塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各组取材前进行神经功能缺损评分,分别于缺血后24 h和72 h,应用免疫组化,Western-blot,MPO活性试剂盒及q RT-PCR方法检测缺血脑组织中MPO表达、MPO活性和炎症介质转录水平的变化。结果:缺血后24 h和72 h,MPO的表达及活性均有升高,肉桂醛(50mg/kg)干预后MPO表达水平及活性下降。1通过免疫组化染色发现,与MCAO组相比,CA50组的MPO阳性细胞表达在24 h和72 h均有显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。2通过Western-blot发现,与MCAO组相比,CA50组MPO蛋白表达水平在24 h和72 h与MCAO组相比显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3与免疫组化染色和Western-blot的结果一致,CA50组的MPO活性在24 h和72 h和MCAO组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。4通过q RT-PCR发现,炎症介质(TNF-α,IL-1β,MCP-1,ELAM-1)在局灶性脑缺后24 h显著升高,肉桂醛(50 mg/kg)于局灶性脑缺血后24 h能够显著降低上述炎症介质的转录水平,差异均具有统计学意义(P0.05)。在局灶性缺血72 h后,和MCAO组相比,CA50组TNF-α和MCP-1 m RNA水平明显减低(P0.05),然而,IL-1β和ELAM-1 m RNA水平没有明显变化(P0.05)。结论:局灶性脑缺血后24 h和72 h,缺血脑组织的炎症介质(炎性因子,趋化因子及粘附因子)的转录水平及MPO表达、活性均显著升高,而肉桂醛能够明显减低缺血脑组织炎症介质的释放、MPO表达及MPO活性,提示肉桂醛能够抑制缺血脑组织炎症介质的释放及中性粒细胞的浸润。而肉桂醛抑制炎症介质释放及中性粒细胞浸润和对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用是一致的,故我们推测肉桂醛可能通过抗炎症损伤发挥其脑保护作用。第三部分肉桂醛对局灶性脑缺血后TLR4/TRAF6/NF-κB通路影响目的:观察脑缺血损伤后不同时间点TLR4/TRAF6/NF-κB通路相关因子的表达变化,研究肉桂醛对局灶性脑缺血小鼠抗炎及神经保护作用的可能信号转导机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,应用改良Longa线栓法制备小鼠右侧大脑中动脉阻塞模型(MCAO)。随机将CD-1小鼠分为3组:假手术组(Sham组),假手术后腹腔注射0.2%DMSO;大脑中动脉阻塞组(MCAO组),小鼠大脑中动脉阻塞后腹腔注射等量0.2%DMSO;肉桂醛中剂量组(CA50组),小鼠大脑中动脉阻塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各组取材前进行神经功能评分,分别用免疫组化,Western-blot和q RT-PCR的方法检测不同时间点缺血脑组织中TLR4,TRAF6及NF-κB蛋白表达和m RNA水平的变化。结果:缺血后24 h和72 h,TLR4、TRAF6及NF-κB的表达均有升高,而肉桂醛(50 mg/kg)降低局灶性脑缺血小鼠脑组织中TLR4、TRAF6及NF-κB表达。1通过免疫组化染色分析发现,与MCAO组相比,CA50组TLR4、TRAF6及NF-κB阳性细胞数在24 h和72 h均明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。2通过Western-blot分析发现,CA50组TLR4、TRAF6及NF-κB蛋白表达水平在24 h和72 h与MCAO组相比显著下降,差异有统计学意义(P0.05)。3与免疫组化染色分析和Western-blot的结果一致,CA50组m RNA水平在24 h和72 h与MCAO组相比明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:局灶性脑缺血后,肉桂醛对缺血脑组织中的TLR4、TRAF6、NF-κB表达的抑制与肉桂醛脑保护作用及抗炎症损伤程度一致,提示肉桂醛有可能通过抑制TLR4/TRAF6/NF-κB炎症通路,从而减轻缺血脑组织的过度炎症反应实现缺血后的脑保护作用。
[Abstract]:Because of its high morbidity , high mortality rate , high disability rate , high recurrence rate and slow recovery , it is very important to find a new scheme for the treatment of ischemic cerebrovascular disease . The effects of cinnamic aldehyde on the brain protection of rats with focal cerebral ischemia were studied by using modified Longa method to evaluate the effects of cinnamic aldehyde on the brain protection of rats with focal cerebral ischemia . The protective effects of cinnamic aldehyde at different time points on brain protection of rats with focal cerebral ischemia were studied . The results showed that the rats were injected intraperitoneally with 0 . 2 % DMSO at 24 h after ischemia , and the rats were injected with 0 . 2 % DMSO immediately after occlusion of the middle cerebral artery . The cerebral infarction volume of CA50 and CA75 groups was significantly lower than that in the middle dose ( 50 mg / kg ) . The results showed that the cerebral infarction volume of CA50 and CA75 groups was significantly lower than that in the middle dose group ( P0.05 ) . The levels of MPO and MPO in CA50 group were significantly lower than those in the middle cerebral ischemia group ( P0.05 ) . The levels of MPO and MPO in CA50 group were significantly lower than those in the middle cerebral ischemia group ( P0.05 ) . The effects of cinnamic aldehyde on anti - inflammatory and NF - 魏B in brain tissue of mice were studied by immunohistochemistry , Western - blot and q - RT - PCR . The inhibition of TRAF6 and NF - 魏B expression is consistent with the protective effect of cinnamyl aldehyde and the degree of anti - inflammatory injury . It is suggested that cinnamic aldehyde may inhibit the inflammatory pathway of IL - 4 / TRAF6 / NF - 魏B , thus reducing the excessive inflammatory response of ischemic brain tissue to protect the cerebral protective effect after ischemia .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.31

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