HIF-1α对低氧环境中脑胶质瘤细胞的作用及相关机制研究

发布时间：2018-03-29 10:14

本文选题：低氧　切入点：葡萄糖剥夺　出处：《昆明医科大学》2015年博士论文

【摘要】：迄今为止,脑胶质瘤的治疗仍无未获得突破性进展,究其原因主要与脑胶质瘤本身所具有的恶性特质有关,包括侵袭性强、易转移复发,放疗耐受及化疗抵抗等方面,已经证实这些恶性特质与其所生长的低氧微环境密切相关。大量的研究发现低氧通过HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α,低氧诱导因子1α)的作用促进与血管生成、转移、糖酵解及耐药相关等基因的表达,从而赋予脑胶质瘤细胞更强的恶性生物学行为。HIF-1α是肿瘤低氧环境下最重要的转录因子,它和HIF-1β形成HIF-1转录复合体后与许多基因启动子内部的HRE结合,引发下游基因的转录,涉及能量代谢、血管生成、细胞分化、细胞增殖和调亡、浸润转移及治疗抵抗。现有研究发现HIF-1α在肿瘤细胞的增殖和凋亡中发挥双向调控的作用,一方面可促进凋亡前体蛋白包括BNIP3、Bax、Bak等的转录,增强抑癌蛋白p53的稳定性从而促进细胞凋亡,另一方面可通过上调抗凋亡因子Bcl-2等因子的作用抑制肿瘤细胞的凋亡,参与发挥低氧诱导的凋亡及对放化疗的抵抗。介于HIF-1α在脑胶质瘤细胞凋亡和增殖中的重要地位,一些研究利用HIF-1α基因沉默的方法对低氧下脑胶质瘤细胞生物学行为的影响开展了相关研究,结果发现HIF-1α沉默可在一定程度上增强脑胶质瘤细胞对放化疗促凋亡作用,从而推断HIF-1α是低氧下脑胶质瘤产生凋亡逃避及放化疗抵抗的主要原因。另外的研究则发现HIF-1α沉默并未明显减弱脑胶质瘤细胞的凋亡抵抗特性,提示低氧下的凋亡逃避可能是多种基因共同参与下的综合作用。综合相关研究发现不同细胞类型HIF-1α在凋亡逃避中所起的作用有所不同,并且可能与肿瘤细胞所处的具体低氧环境差异有关。突变的p53已失去抑癌作用,而在恶性程度更高的肿瘤组织中,同时存在突变的p53蛋白的集聚和HIF-1 α的高表达,二者之间有何交互作用,突变的p53的集聚是否仅作为肿瘤恶性程度的标志还是对低氧下的肿瘤细胞的凋亡逃避发挥作用,目前仍尚未完全明晰。最近有研究证实胶质瘤等实体瘤内存在梯度低氧现象,并认为梯度低氧导致了肿瘤内的不均质性,表现为远隔血管区域的细胞恶性程度更高,低氧程度也更为严重,距离血管较近区域的细胞恶性程度则较低。对于肿瘤细胞耐受低氧的极限,不同来源的肿瘤细胞有所不同,严重低氧可能会促进细胞死亡,也部分细胞则可能会从极限低氧环境中存活。由于受普通培养箱最低氧浓度限制,对于脑胶质细胞究竟能耐受何种程度的低氧,以及在极度低氧下的细胞生存状态及相关的分子机制如何尚缺乏深入的研究?肿瘤细胞的低氧微环境中往往伴有能量物质的缺乏,由此推测低氧微环境中伴随随葡萄糖的缺乏,但对于低氧伴随葡萄糖缺乏的复杂环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的调控尚缺乏系统深入的研究。并且对于HIF-1α不同低氧微环境下脑胶质瘤细胞具体作用及相关机制尚不明确。本研究利用最低氧浓度设置到0.1%的低氧控制器设定不同低氧浓度模拟肿瘤梯度低氧状态,同时结合葡萄糖剥夺的条件模拟脑胶质瘤体内生理状态下的低氧环境,系统研究不同低氧环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的差异,以推测不同低氧环境下凋亡抵抗作用的强弱,为筛选不同低氧环境下的治疗靶标提供依据。同时通过不同低氧环境下HIF-1α和mt-p53的表达变化规律的研究,推测二者在其中的可能作用。利用所构建慢病毒介导shRNA干扰HIF-1α的T98G细胞株,研究HIF-1α沉默对不同低氧环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,再次验证HIF-1α在脑胶质瘤细胞低氧保护中的作用。更重要的是,通过研究HIF-1α沉默对无糖逆境中脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,分析HIF-1α干扰及葡萄糖剥夺之间的交互作用,为寻找一种极限低氧环境下的更为有效治疗靶标提供依据及思路。第一部分梯度低氧及葡萄糖剥夺对人脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响目的：1.探讨梯度低氧对脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响,寻找低氧诱导T98G细胞凋亡的基线水平。1.探讨葡萄糖剥夺对人脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响,研究低氧对葡萄糖剥夺诱导脑胶质瘤细胞凋亡中的作用。方法：1.T98G细胞分别在不同葡萄糖条件下进行梯度低氧(3%O2,0.5O2%,0.1O2%)培养,相应时间段显微镜下观察细胞存活情况。2.培养24h,48h,72h后行Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞凋亡情况,行AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,分析凋亡率。3.按实验分组处理24h、48h、72h、96h及120h后用MTT法检测细胞增殖情况,利用酶标仪在492nm波长下测定各孔吸光值(A值),计算增殖抑制率并绘制细胞生长曲线。结果：1.荧光显微镜观察细胞凋亡(Hoechst染色)：各梯度低氧组细胞均生长良好,胞核完整,无明显细胞凋亡。常氧无糖组及各梯度低氧无糖组48h、72h均有明显细胞凋亡,Hoechst33342染色荧光显微镜下可见凋亡小体。48小时凋亡最为明显的是常氧无糖组,凋亡较3%02无糖组0.5%02无糖组及0.1%02无糖组明显,72h凋亡最为明显的是0.1%低氧无糖组。常氧无糖组及各低氧无糖组均出现细胞形态改变：细胞体积变小,呈细长树枝状,突起明显延长。2.2 AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡：常氧常糖及各低氧常糖在72h内均无明显细胞凋亡(P0.05);而各无糖组(常氧无糖及各低氧无糖组)均有明显细胞凋亡(P0.01),且随时间延长,细胞凋亡率递增(P0.01),3%、0.5%低氧无糖组细胞凋亡率明显低于常氧无糖组(P0.01)。0.1%低氧无糖组24h及48h细胞凋亡率比常氧无糖组低,但72h时高于常氧无糖组(P0.01)。3.MTT结果：单纯低氧可促进T98G细胞增殖,各低氧常糖组细胞生长良好,呈明显增殖趋势,与常氧状态相比,3%O2及0.5%O2可明显促进细胞增殖(P0.05),0.1%低氧组增殖速度减慢。常氧无糖、3%、0.5%和0.1%低氧无糖下增殖明显抑制,曲线走势差异明显(P0.01),72h,3%、0.5%低氧无糖组细胞抑制程度比常氧无糖组轻,而0.1%低氧无糖组细胞增殖抑制最为显著。结论：1.适度低氧促进脑胶质瘤细胞存活及增殖,且当氧浓度低至0.1%,72小时以内仍无明显凋亡,但较常氧下增殖减慢,提示极限低氧在短期内不能作为独立因素诱导胶质瘤细胞发生凋亡,脑胶质瘤细胞具有较强的耐低氧的能力。2.葡萄糖剥夺无论在常氧或者是低氧下均可诱导脑胶质瘤细胞发生凋亡,提示葡萄糖剥夺可独立因素诱导脑胶质瘤细胞快速发生凋亡,脑胶质瘤对葡萄糖剥夺耐受较差。3.0.5%及以上浓度的适度低氧对无糖逆境中脑胶质瘤细胞有一定的抑凋亡和促增殖作用。极度低氧浓度(0.1%)仅在短期内对无糖逆境中胶质瘤细胞具有抑凋亡作用,但随着时间的延长,这种抗无糖逆境抑制凋亡的能力将消失。第二部分：不同低氧及葡萄糖条件对脑胶质瘤细胞HIF-1α及mt-p53表达的调控及与凋亡的相关性研究目的：1.探讨不同低氧及葡萄糖条件下的脑胶质瘤T98G细胞中HIF-1α及mt-p53的表达差异。2.分析不同低氧及葡萄糖条件下的脑胶质瘤细胞增殖和凋亡与HIF-1α及mt-p53表达间的可能关系3.推测HIF-1α及mt-p53在凋亡抵抗中的可能作用。方法：1.将T98G细胞置于不同的氧浓度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及无糖)条件下培养24h、48h、72h,于相应时间段提取总RNA,行real-time PCR检测不同氧浓度条件及葡萄糖条件下的HIF-1α的表达差异。2.将T98G细胞置于不同的氧浓度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及无糖)条件下培养24h、48h、72h,于相应时间段提取总蛋白,行Western Blot检测各组相应时间段HIF-1α及突变的P53蛋白水平的表达变化。3.分析不同条件对HIF-1α及mt-p53的调控与胶质瘤细胞凋亡和增殖变化的相关性,推测二者在脑胶质瘤细胞不同氧浓度及葡萄糖条件下凋亡和增殖中的可能关系。结果：1. Real-time PCR结果显示：常氧常糖组HIF-1α mRNA三个时间段的表达无明显变化。常氧无糖组的HIF-1α mRNA在24h表达短暂上调(P0.01)随后明显降低。0.5%低氧无糖组及0.1%低氧无糖组的HIF-1α mRNA水平呈逐渐降低的趋势。0.1%低氧常糖组在72h则明显下调(P0.01)。而0.5%低氧常糖组HIF-1α mRNA表达水平24h降低,48h后逐渐上调,72h明显上调。2. Western-blot结果示：常氧常糖组HIF-1α 72h内保持较低表达水平,常氧无糖组24h表达量与常氧常糖组比较有明显升高(P0.05),72h降低至较低水平。0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组HIF-1α表达量均于48h上调(P0.05),72h仍维持在较高水平(P0.05)。0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖组,24h HIF-1α表达量上调,48h达最高,72h仍明显高于常氧常糖组(P0.05)。3.不同培养条件下mt-p53表达水平：常氧常糖下,mt-p53蛋白在T98G细胞中有明显表达,72h内未见明显变化。常氧无糖组mt-p53蛋白表达24h下调,72h降至最低水平。0.1%低氧常糖组及0.5%的低氧常糖24h、48h及72h表达量上调,明显高于常氧常糖组(P0.05)。0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖于48h开始下调,72h降至较低水平。4.常氧无糖组HIF-1α蛋白表达量在72h无明显上调,而细胞凋亡仍持续增加,而0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组72h HIF-1α表达量明显上调,凋亡减少,0.5%低氧无糖组72hHIF-1α表达量明显上调,细胞凋亡少于常氧无糖组,经变量转化后Spearman相关分析结果为：细胞凋亡率变化与HIF-1α表达变化呈负相关(r=-0.707,p0.05)。常氧无糖组及0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组,0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖组mt-p53蛋白的表达水平的变化与T98G细胞凋亡率的变化呈负相关(r=-0.933,p0.01),即mt-p53蛋白水平降低,细胞凋亡越增高,蛋白表达水平增高,细胞凋亡率降低。低氧常糖组,48h及72h mt-p53蛋白的表达变化同与HIF-1α的蛋白表达变化呈正相关(r=1,p0.01)。结论：1.极限低氧对HIF-1α的诱导发生在蛋白水平,而葡萄糖剥夺对HI-F1α诱导发生在mRNA水平。2.低氧对T98G细胞抑制凋亡的作用可能与HIF-1α蛋白表达上调有关,并且mt-1953在其中起协同作用,低氧对T98G无糖逆境的保护作用可能缘于HIF-1α及mt-1953蛋白表达的上调。3.葡萄糖剥夺对HIF-1α蛋白表达的上调为短期的应激反应。4.低氧可诱导mt-1953蛋白上调,而葡萄糖剥夺则诱导mt-p53下调。HIF-1α及mt-p53在低氧下均同时上调可能对脑胶质瘤细胞耐极限低氧中有协同作用。第三部分稳定表达HIF-1α基因沉默的人脑胶质瘤细胞系的建立及验证目的：建立慢病毒介导的稳定HIF-1α干扰的人脑胶质瘤细胞系,并验证其在mRNA水平及蛋白水平的敲降效率。方法：1.慢病毒载体HIF-1α-sh9及HIF-1α-sh10及阴性对照scrambled shRNA(ctr)经测序鉴定、纯化,分别与PCMVΔ 8.1.PMD2-G经PEI共转染293T细胞,包装形成慢病毒颗粒。2.慢病毒感染T98G细胞系并经puromyxin抗性筛选。3.提取总RNA及总蛋白,行real-time PCR及Western Blot检测,验证HIF-1 α mRNA及蛋白水平的干扰效果,筛选出最有效的慢病毒载体,建立慢病毒介导的稳定表达HIF-1α基因沉默的人脑胶质瘤T98G细胞系。结果：1.已构建的重组慢病毒HIF-1α-shRNA载体9号(sh9)、10号(sh10)及阴性对照测序(ctr)测序结果正确,sh9、sh10及ctr成功包装成慢病毒颗粒后均可高效感染T98G细胞,经嘌呤霉素puromyxin筛选后无明显细胞死亡。2.0.5%低氧下24h两种质粒对HIF-1α mRNA水平的干扰效率均90%,sh9、sh10分别为97.5%,96.25%。二者在0.5%低氧下,HIF-1α蛋白水平的敲降效率sh9、sh10分别为90.85%,76.59%。结论：两种重组慢病毒HIF-1α-shRNA载体可高效并稳定干扰T98G细胞内的HIF-1α的表达。第四部分慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a对低氧下脑胶质瘤细胞凋亡及mt-p53表达的影响目的：1.研究shRNA干扰靶向抑制HIF-1α表达对脑胶质瘤细胞T98G细胞系在梯度低氧中增殖和凋亡的作用2. shRNA干扰靶向抑制HIF-1α表达对脑胶质瘤细胞T98G细胞系P53表达的影响,寻找HIF-1α及mt-p53之间可能的交互作用以及子低氧下对胶质瘤细胞凋亡和增殖的相关性。方法：1.将已构建成功的HIF-1α-shRNA T98G细胞株与阴性对照的T98G细胞株分别置于0.5%、0.1%及21%的氧浓度条件下培养24h、48h、72h、96h、120h,在相应时间点进行MTT检测,分析其增殖抑制率,绘制生长曲线。2.于21%、0.5%、0.1%的氧浓度条件下培养24h、48h、72h,在相应时间点行AnexinV FITC/PI双染,流式细胞仪检测分析其凋亡率3.同时行real time-PCR检测不同氧浓度条件下HIF-1α-shRNA-T98G细胞株及阴性对照T98G细胞株(ctr-T98G)不同时间段HIF-1α mRNA表达水平的差异。4. Western-Blot方法检测两者不同时间点HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达,分析HIF-1α干扰对mt-p53表达的影响及二者的相关性,分析HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达与T98G细胞凋亡和增殖的关系,探讨可能的分子途径。结果：1.MTT结果示：与对照细胞相比,无论是常氧或是0.1%低氧及0.5%低氧下,HIF-1 α基因沉默的T98G细胞增殖速度均有所减慢(P0.05),并随时间的延长更加明显。2.流式细胞仪检测：常氧下,HIF-1α基因沉默的T98G细胞凋亡率较ctr组在各时间段无明显差异(P0.05)。0.1%低氧、0.5%低氧下,HIF-1α基因沉默的T98G细胞凋亡率在低氧处理48h较ctr组明显增加,72h更加显著(P0.05)。3.T98G细胞中HIF-1α基因在常氧及低氧下mRNA水平及蛋白水平均被有效沉默。在常氧下24h,48h及72h, HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达：96.9%,93.4%,91.5%,二者表达量均有显著性差异(P0.01)；HIF-1α蛋白水平的显著下调达：69%,54%,43%。0.5%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达93.5%,92.6%,88.36%：HIF-1α蛋白水平的下调达：67.8%,71.1%%,80.5%。0.1%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达：97.5%,94.19%,90.3%,二者差异显著(P0.01)。HIF-1α蛋白水平的下调达50.1%,60.9%,63.4%。Sh组各时间段较相对应的ctr组mt-p53蛋白均有不同程度的下调。4.在0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表达水平与T98G细胞凋亡率均呈负相关(r=-0.861, p=0.039; r=-0.625, p=0.037),与常氧下细胞凋亡率之间无明显相关。0.1%氧浓度下及0.5%氧浓度下,HIF-1α表达与mt-p53表达呈高度正相关,分别为：r=0.921, p=0.009, r=0.914, p=0.011。而常氧下,二者的表达则无相关性。结论：1. HIF-1α基因沉默可使人脑胶质瘤细胞T98G增殖速度明显减慢,但细胞仍可缓慢增殖。2. HIF-1α基因沉默使低氧下的人脑胶质瘤细胞T98G凋亡增多,随时间延长凋亡增加明显,凋亡率在20%以内。3. HIF-1α基因沉默可下调mt-p53蛋白的表达,二者在低氧下呈正相关。0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表达水平与T98G细胞凋亡率呈负相关。五部分慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1α表达对无糖逆境中脑胶质瘤细胞凋亡及mt-p53表达的影响目的：1.研究慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a后,脑胶质瘤T98G细胞系在常氧无糖及低氧无糖中细胞凋亡和增殖差异,验证HIF-1α对低氧保护无糖逆境中脑胶质瘤细胞的作用。2.研究慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a对T98G细胞在常氧无糖及低氧无糖下mt-p53表达的影响,分析HIF-1a在葡萄糖缺乏下与mt-p53的可能关系。方法：1.将已构建成功的HIF-1α基因敲降的T98G细胞(shRNA-HIF1α-T98G)细胞株与阴性对照(ctr-T98G)细胞株分别置于常氧常糖,常氧无糖,0.5%的低氧无糖下培养24h、48h、72h、96h、120h,在相应时间点进行MTT检测,分析其增殖抑制率,绘制生长曲线。2.于培养24h、48h、72h,在相应时间点行AnexinV FITC/PI双染,流式细胞仪检测分析其凋亡率。3.同时行Western Blot方法检测不同培养条件下shRNA-HIF1α-T98G细胞株及ctr-T98G细胞株不同时间段HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达水平。4.分析HIF-1α干扰对mt-p53的影响,探讨HIF-1α及p53在脑胶质瘤细胞低氧抗无糖逆境中的可能作用。结果：1. shRNA-HIF-1α-T98G及ctr-T98G各时间段在常氧无糖下随时间延长增殖明显抑制,二者间无显著性差异(p0.05)。两者在低氧无糖下的细胞增殖也随时间延长明显抑制,shRNA-HIF-1α-T98G细胞增殖抑制程度明显高于ctr-T98G细胞,二者间有显著性差异(p0.05),且高于常氧无糖下的ctr-T98G细胞。2. HIF-1α基因敲降的T98G细胞(shRNA-HIF1α-T98G)及与对照组细胞(ctr-T98G)各时间段在常氧无糖下均发生显著凋亡,并随时间延长,凋亡率明显增加,但二者间无明显差异(P0.05)。各时间段,ctr-T98G在0.5%低氧无糖下的细胞凋亡率比常氧无糖低(P0.05)；但shRNA-HIF1α-T98G细胞凋亡率明显高于常氧无糖下ctr-T98G(P0.05)。3.低氧无糖下,HIF1α基因敲降后,T98G细胞凋亡率明显高于常氧无糖下,说明低氧抗无糖逆境的作用随着HIF1α的敲降而丧失,同时mt-p53的表达随之下调,提示在低氧无糖下mt-p53的表达受HIF1α的调控。而常氧无糖下,HIF1α基因敲降并未引起T98G细胞的凋亡率及mt-p53的表达的明显变化。结论：HIF-1α参与脑胶质瘤细胞低氧抗无糖逆境作用,HIF-1α表达上调减少了无糖逆境诱发的细胞凋亡,并调控mt-p53的表达,但mt-p53在低氧抗无糖逆境作用仍不明确。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41

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