调节性T细胞输注移植对缺血性脑卒中tPA溶栓后出血转换的治疗作用及其机制探讨
本文选题：脑卒中 + 调节性T细胞 ； 参考：《复旦大学》2014年博士论文
【摘要】：研究目的：血脑屏障(BBB)破坏是导致缺血性脑卒中严重后果的主要因素之一。组织纤溶酶原激活物(tPA)作为唯一被认可的缺血性脑卒中的溶栓治疗药物,在溶栓治疗缺血性脑卒中的同时,可以恶化BBB的破坏,进而导致出血转换(Hemorrhagic transformation,HT)的发生。因此非常有必要开发新型的BBB保护药物,减少缺血再灌注损伤,提高tPA治疗的安全性。我们近期的研究表明调节性T细胞(Tregs)输注移植可以通过保护BBB从而有效保护缺血性脑卒中后脑组织。本研究旨在进一步探讨调节性T细胞(Tregs)输注移植是否同样可以通过有效保护BBB,而减少tPA溶栓治疗导致的出血转换,提高其使用安全性,并进一步探讨Tregs对缺血性脑卒中损伤后血脑屏障的保护作用机制。研究方法：缺血性脑卒中模型采用小鼠MCAO缺血2h再灌注模型。tPA(10mg/kg)在MCAO后通过股静脉缓慢(20分钟)注入受体鼠体内。从供体小鼠血和脾脏内分离提取Treg细胞,注完tPA后立即将Treg细胞注入受体小鼠股静脉内。脑出血量用血红蛋白分光光度计法定量。MCAO术后24小时评价血脑屏障的完整性。脑组织梗死或缺损体积检测以及神经功能评价持续至术后21天。为了探究Treg对BBB的保护作用机制,我们在体外实验中运用transwell细胞培养系统或者细胞直接共培养系统将Treg细胞和中性粒细胞分开或者混合共培养。局灶性缺血性脑卒中模型采用缺血60分钟小鼠MCAO模型。从供体小鼠(野生型或者PD-L1-/-型)体内分离提取Treg细胞(2x106),在MCAO再灌2h后静脉注入受体小鼠。术后1天或3天进行MMP-9表达量,BBB完整性以及脑梗死的评价。研究结果：小鼠MCAO模型缺血性脑卒中2小时再灌注后静脉注入tPA,术后24小时在缺血区可以看到明显的出血转换。Treg细胞输注移植后可以显著减少tPA引发的缺血性脑卒中后出血转换。进一步研究发现,Treg输注移植可以减少血浆渗出至脑组织的IgG以及外源性Evens blue的量,另外免疫组织荧光染色结果显示,Treg输注移植还有助于保存紧密连接相关蛋白ZO-1和Claudin-7等的完整性,这些结果说明Treg输注移植可以有效减少tPA溶栓治疗诱发的BBB的破坏。通过明胶酶谱方法和免疫荧光染色发现,Treg通过减少外周血和脑内MMP-9的水平和活性,达到有效抑制BBB破坏的保护作用。同时,Treg输注移植还可有效减少局灶性缺血性脑卒中tPA溶栓治疗后脑组织梗死或缺损体积,并能显著改善神经功能,持续至术后21天。体外实验结果显示Treg细胞抑制中性粒细胞源性MMP-9的作用必须通过细胞-细胞直接接触实现。当Tregs经过PD-L1中和抗体预处理或者中性粒细胞经过PD-1中和抗体预处理后,Treg细胞抑制MMP-9的作用消除。体内试验中,Treg细胞用PD-L1中和抗体预处理,或者取自PD-L1基因敲除小鼠体内的Treg细胞静脉输注入MCAO受体小鼠体内1天后,血液中中性粒细胞表达MMP-9没有得到明显抑制。另外,在PD-L1功能完整的受体小鼠,Treg细胞保护血脑屏障的作用效果明显,但是在PD-L1功能缺陷的受体小鼠,Treg细胞保护血脑屏障的作用效果不明显,PD-L1功能缺陷可消除Treg细胞的脑保护作用,影响MCAO后3天的神经功能改善。研究结论：我们研究结果表明Treg输注移植能有效减少缺血性脑卒中tPA溶栓再灌治疗导致的BBB破坏以及出血转换。Treg细胞疗法很有潜力成为提高tPA溶栓再灌治疗安全性的有效辅助策略。此外,我们的研究还发现PD-L1通过介导Treg细胞对中性粒细胞源性MMP-9的抑制作用,在Treg细胞输注移植介导的神经保护作用中发挥至关重要的作用。
[Abstract]:In order to study the protective effect of Treg on ischemic stroke , it is necessary to develop new BBB protective drugs , reduce the damage of blood brain barrier and improve the safety of blood brain barrier .
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3
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，本文编号：1877791
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