【摘要】：第一部分IL-17A在缺血性脑卒中(CIS)恢复期的表达变化以及神经再生和功能恢复的影响 目的：确定CIS后IL-17A的时间与空间表达趋势,以及明确IL-17A是否可促进CIS后神经再生与功能恢复。 方法：成年雄性IL-17A敲除(IL-17A knock-out,il-17a-/-)或野生型(wide-type, WT)小鼠大脑中动脉栓塞,缺血60分钟后再灌注。野生型小鼠从CIS后14天开始,连续14天经鼻腔给予重组白介素17A蛋白(recombinant IL-17A, rIL-17A)或溶剂对照(vehicle),或者经侧脑室给予小鼠IL-17A中和抗体(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型对照抗体。CIS后27天腹腔注射BrdU,间隔8个小时,16小时后灌注取材检测祖细胞增殖活性。CIS后7天腹腔注射BrdU,间隔8个小时候再次注射一次,连续注射7天,35天灌注取材检测祖细胞寿命。CIS后1、3、7、14、21、28、42或70天免疫印迹和实时定量PCR检测缺血侧大脑半球IL-17A的表达。CIS后7、14、21或28天免疫荧光和免疫印迹检测脑室下区(subventricular zone, SVZ)和海马区IL-17A的表达。CIS后28或35天免疫细胞化学染色溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU),Ki67,磷酸化组蛋白H3(phospho-histone H3, PH3),双皮质素(doublecortin, DCX)。CIS后35天免疫细胞化学检测β3-tubulin和突触素(synaptophysin);免疫印迹检测突触小体相关蛋白-25(synaptosomal-associated protein-25kDa, SNAP-25);以及小鼠行为学评分。 结果：免疫印迹和实时定量PCR结果显示与假手术组相比,CIS后7、14、21和28天缺血侧大脑半球IL-17A的基因与蛋白表达水平显著升高,28天达峰值。缺血侧SVZ和纹状体区IL-17A阳性细胞数在CIS后7、14、21和28天显著增加。CIS后28天,抑制IL-17A可显著减少纹状体BrdU+/DCX+细胞数,而rIL-17A可显著增加纹状体BrdU+/DCX+细胞数。然而抑制IL-17A或rIL-17A不影响CIS后28天SVZ区BrdU+、Ki67+或PH3+细胞数。CIS后35天,抑制IL-17A显著减少缺血侧SVZ区BrdU+、 BrdU+/DCX+细胞数,显著减少纹状体BrdU+/DCX-细胞数,而rIL-17A则增加缺血侧SVZ区BrdU+、BrdU+/DCX+细胞数,显著增加纹状体BrdU+/DCX+6细胞数。抑制IL-17A还可显著减少缺血侧纹状体BrdU+/pⅢ-tubulin+细胞数,减少SNAP-25和synaptophysin的表达,显著抑制CIS后神经功能的恢复,rIL-17A可显著增加BrdU+/βⅢ-tubulin+细胞数,增加SNAP-25和synaptophysin的表达,显著促进CIS后神经功能的恢复。 结论：CIS恢复期在SVZ和纹状体区升高的IL-17A可显著增加SVZ区神经祖细胞寿命,促进神经元分化和突触再生,从而促进神经功能恢复。 第二部分p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/calpain1信号通路在CIS后IL-17A的促神经再生中的作用 目的：探讨白介素17A促进CIS后神经再生的分子生物学机制。 方法：WT小鼠大脑中动脉栓塞,缺血60分钟后再灌注。小鼠从CIS后14天开始,连续14天经鼻腔给予重组白介素17A蛋白(recombinant IL-17A, rIL-17A)或溶剂对照(vehicle),或者经侧脑室给予小鼠IL-17A中和抗体(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型对照抗体。CIS后27天腹腔注射BrdU,间隔8个小时,16小时后灌注取材检测祖细胞增殖活性。其中部分小鼠在鼻腔给予rIL-17A前30分钟腹腔给予p38通路抑制剂SB203580或1%DMSO,或者经侧脑室给予calpain1抑制剂PD151746或1%DMSO。CIS后28天免疫印迹检测IL-17A,磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinase, p-ERK),磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phospho-c-Jun N-terminal kinase, p-JNK),磷酸化AKT(p-AKT),磷酸化p38(p-p38),all-spectrin, calpain1和calpain2的蛋白表达。CIS后35天免疫细胞化学染色BrdU、 DCX、β3-tubulin和突触素(synaptophysin);免疫印迹检测SNAP25。 结果：IL-17A敲除,中和抗体中和IL-17A或rIL-17A干预均不影响CIS后28天缺血侧脑组织p-ERK,p-JNK, p-AKT和calpain2的蛋白表达；抑制IL-17A显著减少缺血侧脑组织p-p38蛋白表达；而rIL-17A干预显著增加p-p38蛋白表达。IL-17A敲除,中和抗体中和IL-17A可显著增加CIS后28天总calpain和calpain1的活性,而rIL-17A干预则显著抑制总calpain和calpain1的活性。SB203580可显著增加CIS后28天缺血侧脑组织calpain1活性。提前加入SB203580则可阻断IL-17A对总calpain和calpain1活性的抑制作用。然而PD151746则对IL-17A和p-p38的蛋白表达无显著影响。PD151746干预可显著增加CIS后35天缺血侧纹状体BrdU+/DCX+和BrdU+/β3-tubulin+细胞数,也显著增加synaptophysin和SNAP25的表达。 结论：IL-17A通过p38MAPK/calpain1信号通路促进CIS后神经再生。 第三部分IL-17A在CIS后的细胞来源以及分泌机制 目的：明确IL-17A在CIS恢复期的细胞来源,以及探讨其细胞分泌机制。 方法：WT小鼠大脑中动脉栓塞,缺血60分钟后再灌注。CIS后28天免疫荧光双染IL-17A和星形胶质细胞标记GFAP,神经元标记NeuN或小胶质细胞标记Iba-1。CIS后14天缺血侧SVZ区提取的原代星形胶质细胞培养,100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)干预后免疫荧光和免疫印迹分别检测细胞裂解液和培养上清液中IL-17A的蛋白表达；p38MAPK特异性抑制剂SB203580或1%DMSO在LPS干预前30分钟加入原代星形胶质细胞培养液中。 结果：在体实验结果表明IL-17A与星形胶质细胞标记GFAP共表达,而不与小胶质细胞标记Iba-1或神经元标记NeuN共表达。体外培养的原代星形胶质细胞实验结果显示,LPS可显著增加细胞裂解液和培养上清液中IL-17A的蛋白表达;而加入SB203580后,LPS对细胞裂解液和培养上清液中IL-17A的表达促进作用显著被抑制。 结论：星形胶质细胞是CIS恢复期IL-17A的主要细胞来源；星形胶质细胞分泌IL-17A依赖于p38MAPK信号通路。 第四部分IL-17A对体外培养的SVZ区神经祖/干细胞的增殖和分化的影响及其作用机制 目的：研究IL-17A对体外培养的原代神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells, NSCs)的增殖分化的影响,并探讨其作用机制。 方法：成年雄性IL-17A敲除(IL-17A knock-out, il-17a-/-)或野生型(wide-type, WT)小鼠大脑中动脉栓塞,缺血60分钟后再灌注。CIS后-14天分离缺血侧SVZ区NSCs培养。第二代神经球接种后增殖,WT小鼠CIS后来源的第二代NSCs增殖液中连续7天给予0、10、50和100ng/ml rIL-17A干预后24小时计数神经球数量；收集细胞接种后分化,加入BrdU后16小时免疫荧光检测BrdU阳性细胞的比例。来源于il-17a-/-小鼠的第二代NSCs分化后7天,以及rIL-17A(0、10、50和100ng/ml)或活化的星形胶质细胞培养上清(加或不加anti-IL-17A mAb)干预的WT小鼠第二代NSCs分化后7天,免疫荧光双染β3-tubulin和GFAPc IL-17A中和抗体(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型对照抗体与rIL-17A于分化开始后2小时同时加入分化液中。p38MAPK特异性抑制剂SB203580在干预前30分钟加入分化液中。第二代NSCs分化后2小时加入calpain1特异性抑制剂PD151746,连续给7天。免疫印迹检测p-p38, calpain1和calpain2的蛋白表达。 结果：IL-17A敲除后NSCs分化为β3-tubulin阳性神经元显著减少；10或50ng/ml rIL-17A干预或者活化的星形胶质细胞上清干预后NSCs分化为β3-tubulin阳性神经元显著增加,而分化为GFAP阳性星形胶质细胞显著减少。Anti-IL-17A mAb显著阻断活化的星形胶质细胞上清对NSCs神经元分化的促进作用。给予rIL-17A显著增加p-p38蛋白表达和calpain1活性。rIL-17A对p-p38蛋白表达的促进作用以及对calpain1活性的抑制作用可被anti-IL-17A mAb显著阻断。预先给予SB203580显著阻断rIL-17A对calpain1活性的抑制作用；而PD151746对p-p38蛋白表达无显著影响。PD151746显著增加NSCs 分化为β3-tubulin+神经元而减少GFAP+星形胶质细胞。 结论：IL-17A通过p38MAPK/calpain1信号通路促进体外培养的原代NSCs的神经元分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
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本文编号：
2252069
