脑胶质瘤IDH基因突变HRM检测方法的建立

发布时间：2018-12-09 12:32

【摘要】：异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase）IDH1基因定位于2q33.3染色体上，全长18,841bp，其中包括9个内含子和10个外显子；IDH2基因定位于15q26.1，全长18,498bp，其中包括11个内含子和12个外显子。它们编码的异柠檬酸脱氢酶参与TCA循环，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，与细胞缺氧诱导因子（HIF）的稳定性相关，而HIF表达与肿瘤不同的恶性行为相关。已有文献报道在大部分胶质瘤中有IDH基因突变的患者有良好的预后效果。因此通过检测IDH突变可对胶质瘤患者的预后作出一定的预测，对临床工作有指导意义。本文拟通过提取胶质瘤石蜡包埋组织DNA，优化PCR反应条件，初步建立IDH基因突变高分辨率熔解曲线（high resolution melting, HRM）检测方法，验证反应体系的检测灵敏度和稳定性。通过与DNA直接测序法和免疫组化法的比较，统计分析标本参数与qPCR-HRM检测IDH1基因突变结果的相关性，探讨qPCR-HRM法检测IDH基因突变的优势和临床应用的可行性。首先对HRM检测技术参数进行优化：提取脑胶质瘤患者石蜡包埋组织标本标本中DNA，采用温度梯度PCR、正交设计和响应面实验，优化IDH的qPCR-HRM反应体系和反应条件。分别将IDH基因野生型和突变型DNA梯度混合稀释，进行qPCR-HRM反应，并将扩增产物进行DNA直接测序，比较两种方法的最低检出限。将IDH突变型和野生型胶质瘤标本同时重复检测15次；以及每隔30天检测一次，共检测3次，，观察qPCR-HRM方法的重复性。将IDH基因突变型DNA依次稀释后进行qPCR-HRM检测，分析最低检测模板量。其次是对51例人胶质瘤标本进行IDH基因突变检测：对石蜡包埋组织标本进行切片，行HE染色和IDH1免疫组化检测；提取胶质瘤组织DNA，按照优化的qPCR-HRM反应条件进行IDH基因突变检测，并与DNA直接测序法比较。观察统计分析标本中肿瘤细胞数量、患者年龄、性别和胶质瘤分级与突变检出结果之间的相关性并进行统计学分析。采用SPSS13.0统计软件进行数据处理分析，组间检出率的比较采用卡方检验，多因素与突变检出结果的相关性分析采用logistic回归分析，选取检验水准α=0.05。结果显示：IDH1基因的qPCR最佳退火温度为53℃，20μl反应体系中最佳反应体系为：引物浓度为0.6μmol/L，Mg2+为2.5mmol/L，模板DNA为60ng。IDH2基因响应面分析结果证明20μL qPCR-HRM反应体系中，引物浓度0.6umol/l，模板量45ng，Mg2+浓度2.75mmol/l，退火温度52.5℃为最佳。IDH1和IDH2qPCR-HRM法的最低检出限分别为0.5%、1%；IDH1和IDH2直接测序法的最低检出限分别为40%、80%，提示qPCR-HRM方法比直接测序法灵敏度高。IDH1和IDH2的qPCR-HRM重复性检测显示批内批间的重复性良好。qPCR-HRM方法检测IDH1和IDH2基因的DNA模板量最低分别为0.5ng和1ng。在51例人胶质瘤标本中，qPCR-HRM法共检测出33例脑胶质瘤石蜡组织标本为IDH1基因突变型，2例脑胶质瘤石蜡组织标本为IDH2基因突变型，其余均为野生型。经统计分析IDH基因突变的HRM检测结果与DNA直接测序和免疫组化检测法一致。logistic回归分析结果表明标本肿瘤细胞数量、患者年龄、性别与IDH1基因突变检出率有显著性关系（P＞0.05）。综上所述，本研究建立的脑胶质瘤IDH基因突变qPCR-HRM检测方法具有灵敏度高，重复性好，操作简便，结果准确特点，将为临床胶质瘤石蜡包埋组织标本IDH基因突变的检测提供了一种新方法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】