锌离子在HDAC6介导的tau蛋白经自噬-溶酶体途径降解中的作用研究

发布时间：2019-04-26 02:31

【摘要】：异常蛋白聚集是神经退行性疾病的一个重要病理性标志,探究细胞内异常蛋白聚集的降解机制对于治疗神经退行性疾病有重要的临床意义。阿尔茨海默病等tau相关的神经退行性疾病常表现为微管相关蛋白tau的异常聚集以及异常翻译后修饰等,该病理特征的产生与细胞内的蛋白降解系统的功能障碍直接相关。Tau蛋白既是泛素-蛋白酶体系统又是自噬-溶酶体系统的降解底物,在tau相关疾病中,蛋白酶体的活性明显下降。当蛋白酶体发生功能障碍时,组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase6, HDAC6)可与泛素化修饰的错误折叠蛋白及动力蛋白结合形成复合物,并将这些泛素化修饰的蛋白沿微管运输到微管组织中心形成功能性聚集体(aggresome)结构,最终通过自噬-溶酶体进行降解。HDAC6的锌指结构域包含3个锌离子的结合位点,该结构域介导了HDAC6与泛素化蛋白的结合,且锌离子参与了两者结合过程的调节。锌离子缺乏能够导致与学习记忆相关的神经病变的发生,如阻碍神经元迁移,突触发生和突触传递等。然而,目前关于锌离子异常在神经退行性疾病中的作用和相关的分子机制尚不明确。为了探讨在tau相关的神经退行性疾病中,锌离子异常对tau蛋白降解的作用和机制,本研究选取HEK293/tau441细胞为模型,用蛋白酶体活性抑制剂MG132处理细胞阻断tau蛋白经泛素-蛋白酶体途径的降解,诱导tau蛋白的泛素化修饰,研究锌离子含量异常对HDAC6介导的tau蛋白经白噬-溶酶体途径降解的作用。方法：用MG132(2μM)预处理HEK293/tau441细胞2hr后,添加锌离子螯合剂TPEN (2μM)处理细胞6hr,诱导锌离子缺乏,并在添加TPEN (2μM)的基础上补充外源性锌离子(5μM ZnSO4)处理细胞6hr探索逆转效应。使用免疫印迹技术检测细胞内总tau蛋白,自噬体激活标志物LC3以及HDAC6的含量变化,同时使用HDAC活性试剂盒检测HDAC6的活性改变,探讨锌离子含量改变对HDAC6含量和活性的影响,以及tau蛋白经白噬-溶酶体途径的降解变化；此外使用免疫荧光技术检测tau蛋白功能性聚集体形成的改变,使用免疫沉淀方法检测HDAC6与tau蛋白之间结合力的改变,探讨锌离子在HDAC6介导的tau蛋白功能性聚集体形成过程中的作用机制。结果表明：(1)与对照组相比,蛋白酶体活性抑制导致tau蛋白含量增加(p0.01),白噬体被激活；与MG132组相比,锌离子缺乏导致tau蛋白的含量显著增加(p0.01),自噬标志物LC3的表达显著下调(p0.01)；与MG132+TPEN组相比,添加外源性锌离子能够逆转TPEN诱导的tau蛋白含量和自噬体活性的改变；(2)与对照组相比,蛋白酶体活性抑制可以上调HDAC6的活性(p0.01)和含量(p0.01)；与MG132组相比,锌离子缺乏下调HDAC6的活性(p0.001),与MG132+TPEN组相比,添加外源性锌离子能够缓解TPEN诱导的HDAC6活性下调,但与MG132组相比HDAC6的活性依然呈下调状态(p0.01),而与MG132组相比,锌离子含量的改变对HDAC6的含量并无明显改变；(3)与对照组相比,蛋白酶体活性抑制诱导tau蛋白功能性聚集体的形成；与MG132组相比,锌离子缺乏导致tau蛋白功能性聚集体形成受阻；与MG132+TPEN组相比,补充外源性锌离子可促进tau蛋白功能性聚集体的形成；(4)与对照组相比,蛋白酶体活性抑制导致HDAC6与tau蛋白之间结合增强；与MG132组相比,锌离子缺乏使得HDAC6与tau蛋白之间结合减弱；与MG132+TPEN组相比,补充外源性锌离子使得HDAC6与tau蛋白之间的结合增加。以上结果表明,在蛋白酶体活性抑制下,锌离子缺乏能够下调HDAC6活性,阻碍HDAC6与tau蛋白之间的结合,.从而使得HDAC6介导的tau蛋白功能性聚集体形成受阻,进而使得tau蛋白经自噬-溶酶体途径的降解被抑制,tau蛋白含量增加。本研究初步探明了锌的含量异常在tau蛋白降解过程中的作用机制,为确立HDAC6作为tau蛋白病变的治疗靶标提供了依据。
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【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

【参考文献】