【摘要】：多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种累及中枢神经系统的自身免疫性疾病,目前病因不明,可能与遗传、居住环境、饮食、营养以及体内激素变化等有关。MS的起病源自与自身髓鞘结构相似的抗原激活CD4+T细胞,激活后的CD4+T细胞分化为Th1,Th17等效应细胞,攻击自身髓鞘组织,引发髓鞘脱失和轴索损伤。MS患者的症状多种多样,可有疲劳、肢体瘫痪、麻木、视力下降、自主神经功能紊乱等,由于MS主要发病于中青年,症状往往迁延反复,不断恶化直至残疾,给家庭和社会带来了巨大的负担。MS的治疗主要分为急性期治疗和缓解期治疗,急性期主要采用激素、免疫球蛋白冲击、血浆置换等;缓解期主要采用β-干扰素,改善病程治疗药物等。但是,目前的治疗手段只对部分患者有效且不能彻底治愈MS。本研究的目的是在MS的动物模型:实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)上研究新的治疗方法,为临床应用提供理论支持。本研究的第一部分研究骨髓来源的神经干细胞(Bone Marrow-derived Neural Stem Cell,BM-NSC)对EAE的治疗效果,同时应用TGF-β1基因修饰BM-NSC,制作过表达TGF-β1的BM-NSC(TGF-β1-BM-NSC),比较TGF-β1-BM-NSC与普通BM-NSC对EAE治疗作用的差异。本研究第二部分检验了HIF-1抑制剂BAY87-2243对EAE的治疗作用,同时研究了BAY 87-2243对中枢和外周免疫系统的调节作用以及对少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)增殖分化的影响。第一部分:过表达TGF-β1的骨髓来源神经干细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎治疗作用的研究方法:(1)培养BM-NSC并使用包含TGF-β1基因的逆转录病毒感染BM-NSC,筛选出TGF-β1-BM-NSC;(2)使用MOG35-55诱导EAE模型,在EAE发病前与发病高峰期分别尾静脉注射1×106的BM-NSC,TGF-β1-BM-NSC或同等剂量的生理盐水;(3)每日评估EAE临床症状评分和体重;(4)相应时间点处死小鼠,提取中枢神经系统内的CD4+T细胞,使用流式细胞仪分析Th1,Th17以及Treg细胞的比例;(5)流式细胞仪分析EAE小鼠外周免疫系统内CD4+T细胞特异性分化为Th1,Th17以及Treg细胞的比例;检测EAE小鼠外周免疫细胞抗原特异性的增殖和炎性因子分泌能力;(6)对EAE小鼠脊髓组织行HE和LFB染色,观察中枢内炎性浸润和炎性脱髓鞘情况;(7)制作中枢神经组织冰冻切片,观察BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC在体内的分化。结果:(1)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC皆可生长为典型的神经球,分化为神经元,少突胶质细胞和星形胶质细胞;BM-NSC培养液的上清中几乎检测不出TGF-β1,而TGF-β1-BM-NSC培养液的上清中TGF-β1的平均浓度为488 pg/ml;(2)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC注射均可以延缓EAE的发病,减轻EAE小鼠的残疾症状;(3)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC注射均可以减轻EAE小鼠中枢神经系统内的炎性细胞浸润和髓鞘脱失;(4)相对于生理盐水治疗组,BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC治疗组EAE小鼠中枢神经系统内的CD4+T细胞的比例和数量明显降低,Th1细胞的比例和数量明显降低,Th17以及Treg细胞的数量降低;(5)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC显著降低EAE小鼠周围免疫系统中CD4+T细胞向Th1及Th17细胞分化的比例,增加Treg细胞分化的比例;同时降低外周淋巴细胞的抗原特异性增殖和炎症因子的分泌;(6)注射的BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC在EAE小鼠中枢神经系统内分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,也有部分NSC未分化,保持干性;(7)相比于普通BM-NSC,TGF-β1-BM-NSC缓解EAE临床症状评分,减轻中枢神经系统炎性浸润和髓鞘脱失,调节免疫的能力有所增强,而在体内以及体外分化为各种神经细胞的比例与普通BM-NSC无明显差异。讨论:由于TGF-β1可以单独诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的生成,所以我们将TGF-β1基因导入BM-NSC,希望增强其调节免疫和治疗EAE的能力。从实验结果可以看出,TGF-β1-BM-NSC治疗明显增加了外周免疫系统内Treg细胞的比例,相应地Th1及Th17细胞的比例则明显下降。此外,TGF-β1的导入还降低了炎性因子的分泌和外周免疫细胞抗原特异性的增殖,我们推测这可能是由于外周Treg细胞比例的上升所引发的对于免疫反应的负性调节的结果。由于对外周异常免疫反应抑制的增强,进入中枢的CD4+T细胞的比例和数量均明显下降,相应地,EAE小鼠的临床症状和炎性脱髓鞘也明显地减轻。综上,BM-NSC可以有效缓解EAE的症状,而过表达TGF-β1的BM-NSC由于调节免疫的能力增强,对EAE的治疗作用显著增强。第二部分:HIF-1抑制剂BAY 87-2243对实验性自身免疫性脑脊髓炎治疗作用的研究方法:(1)使用台盼蓝染色和MTS试剂盒检测不同浓度的BAY 87-2243在体外对CD4+T细胞数量和活性的影响;(2)分别使用Brd U试剂盒和Annexin V-PI复染检测不同浓度的BAY 87-2243对CD4+T细胞增殖和凋亡的影响;(3)流式细胞仪检测不同浓度的BAY 87-2243对CD4+T细胞向Th1,Th2,Th17以及Treg细胞分化的影响;(4)检测不同浓度的BAY 87-2243对OPC增殖和分化的影响;(5)诱导EAE模型并在EAE发病前和高峰期后分别口服给予4 mg/kg的BAY 87-2243,记录EAE小鼠的临床症状评分;(6)见第一部分方法(4)至(6)。结果:(1)1至1000 n Mol的BAY 87-2243在体外不影响CD4+T细胞的数量和活力;(2)1至1000 n Mol的BAY 87-2243在体外不影响CD4+T细胞的凋亡,低浓度的BAY(1至100 n Mol)不影响CD4+T细胞的增殖,高浓度的BAY 87-2243(500n Mol,1000 n Mol)抑制CD4+T细胞的增殖;(3)BAY 87-2243显著地降低CD4+T细胞向Th1,Th17细胞的分化,而促进Treg细胞的分化;(4)BAY 87-2243促进低营养条件下OPC的增殖,但并不影响其分化为成熟的少突胶质细胞;(5)BAY87-2243可以延缓EAE的发病,降低EAE小鼠的临床残疾评分,减轻中枢神经系统内的炎性浸润和髓鞘脱失;(6)BAY 87-2243显著减少了EAE小鼠中枢内的CD4+T细胞的比例和数量,Th1及Th17细胞的数量也明显降低;(7)BAY 87-2243显著降低EAE小鼠周围免疫系统中CD4+T细胞向Th1及Th17细胞分化的比例,增加向Treg细胞分化的比例;同时减轻了外周淋巴细胞的抗原特异性增殖和炎症因子的分泌;(8)BAY 87-2243抑制了EAE小鼠中枢内HIF-1α的表达。讨论:HIF-1在控制CD4+T细胞向Th17/Treg细胞的分化中扮演关键角色,其可以促进CD4+T细胞向Th17细胞分化,抑制其向Treg细胞分化。所以我们引入HIF-1的特异性抑制剂BAY 87-2243,将其应用于EAE的治疗,希望可以抑制Th17细胞的生成,增加Treg细胞的生成。实验结果显示BAY 87-2243确实可以通过抑制HIF-1α的表达来调节免疫。口服BAY 87-2243后,治疗组EAE小鼠外周免疫系统内的Th1和Th17细胞比例明显下降,而Treg细胞的比例明显升高,此外,抗原特异性的淋巴细胞增殖和促炎因子的分泌也被抑制。从临床评分上也可以看出BAY87-2243可以延缓、减轻EAE小鼠的临床残疾症状,中枢神经系统的髓鞘脱失也有所减轻。以上的结果印证了我们的设想,BAY 87-2243通过特异性抑制HIF-1,调整Th17/Treg细胞的分化平衡,发挥对EAE的治疗作用。全文总结通过上述两部分的研究,我们分别评估了TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243对EAE的治疗作用,实验结果显示TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243都可以延缓、减轻EAE的症状,促进EAE小鼠神经功能的恢复,这对于MS的治疗是十分有价值的。两种治疗手段都是通过调节免疫尤其是Th17/Treg细胞的平衡来发挥治疗作用,此外,TGF-β1-BM-NSC还可以通过神经营养和细胞修复作用来促进髓鞘修复,而BAY 87-2243同样可以在低营养条件下增强OPC的增殖来促进内源性髓鞘修复。综上,本研究充分证明了TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243对EAE的治疗作用,为临床治疗MS提供了新的思路。
文内图片：
图片说明： 图 1：BM-NSC 的培养A：培养骨髓来源的 NSC，，悬浮培养，传 3 代后，细胞成球状，Nestin 阳性（100×）；B：贴壁后，细胞生出突起，仍 Nestin 阳性（100×）。
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图片说明： TGF-β1-BM-NSC 与对照 BM-NSC 以不同密度种植于 96 孔细胞培养板，使用 Br标记检测增殖能力。如图 4 所示：两种 BM-NSC 的增殖曲线几乎相同，随着种植度的增加，BrdU 吸收值逐渐增高，由 102/ml 时的 0.2 增加到 105/ml 时的 0.9，而景（无 BrdU）吸收值为 0.1。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.51
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本文编号：
2512980
