PRRT2突变体导致谷氨酸释放及GRIA1膜表面分布异常
发布时间：2020-02-22 17:42
【摘要】：发作性运动源性舞蹈手足徐动症(PKC, OMIM 128200)又被称作发作性运动源性肌张力障碍,最早在1976年被发现,是最常见的阵发性运动障碍疾病。其临床表现主要为突发的不自主运动,主要包括肌张力障碍姿势、舞蹈病以及手足徐动等,一般由静态转变为运动状态或者改变运动速度诱发。本课题组与国内外的其他研究学者同时于2011年发现位于16p11.2编码富含脯氨酸的二次跨膜蛋白PRRT2的基因杂合突变会导致PKC发生,因而PRRT2基因被认为是PKC的致病基因。蛋白质结构预测发现在PRRT2的N端有一段富含脯氨酸的序列和一个糖基化位点,而在C端有两个在物种间高度保守跨膜结构域。在小鼠研究中发现,Prrt2主要表达在神经系统中,并且在大脑皮层、海马以及小脑的表达量最高。目前对PRRT2的功能尚不清楚,Lee等通过免疫共沉淀实验证实了PRRT2与SNAP25之间的相互作用,并且发现在病人中出现频率最高的PRRT2 p.R217Pfs*8截短突变体丧失表达。SNAP25是t-SNARE家族的成员,参与形成神经细胞外泌的膜融合装置,也在兴奋性氨基酸递质的释放中发挥重要作用。而兴奋性氨基酸递质尤其是谷氨酸的释放失调在癫痫、偏头疼以及自闭症等神经系统疾病中起着关键作用。另一方面,在2012年一项高分辨率蛋白质组学研究发现了21种新的参与形成非变性a-氨基-3-羟基-5-甲基1-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体的蛋白,其中就包括PRRT2,并且发现PRRT2与内部核心亚基GRIA1之间联系紧密。为了研究PRRT2的蛋白功能,本研究首先用高效液相色谱分析方法检测了7例PKC病人以及12例正常对照受试者血清中三种兴奋性氨基酸类神经递质的含量。结果表明PKC病人血清中天冬氨酸和谷氨酸的含量明显高于正常对照受试者。随后,用可以敲除Prrt2表达的shRNA慢病毒感染原代培养的小鼠皮层神经元进行功能缺失实验。用高效液相色谱分析检测培养基中兴奋性氨基酸的含量,发现干扰组培养基中谷氨酸的含量明显高于对照组。结果显示PRRT2可能在调节谷氨酸的释放中发挥抑制作用。更重要的是多重染色免疫荧光结果显示Prrt2定位在谷氨酸能突触上,这与它的功能相一致。为了进一步研究PRRT2 与 SNAP25之间的相互作用,构建了PRRT2 WT, p.R217Pfs*8以及p.A287T过表达载体,其中p.A287T是本课题组发现的错义突变体。通过免疫共沉淀实验发现p.A287T错义突变PRRT2与SNAP25之间的相互作用减弱,提示突变的PRRT2可能通过调节与SNAP25之间的相互作用来调节谷氨酸的释放。为了进一步寻找与PRRT2存在相互作用的蛋白,通过体内以及体外免疫共沉淀实验证实了PRRT2与GRIA1之间的相互作用,而且与野生型PRRT2相比,PRRT2突变体与GRIA1之间的相互作用减弱。更为有意义的是通过体外活细胞染色实验发现PRRT2突变体可以使GRIA1在细胞膜表面的分布增加,而这可能会影响AMPA受体的功能。总之,本研究发现,在PKC病人血清中以及敲除Prrt2表达的神经元培养基中谷氨酸的含量明显升高。进一步研究发现错义突变的PRRT2与SNAP25之间的相互作用减弱,提示了PRRT2发挥功能的方式。最后,本研究首次证实了PRRT2与GRIA1之间的相互作用,而PRRT2突变体会干扰这种相互作用并且使GRIA1在细胞膜表面的分布增加。本研究表明,PRRT2突变体导致谷氨酸信号通路异常。
【图文】：
ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２邋（ｓｈＲＮＡ－１）。通过邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣ艮检测，发现邋ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２邋序列可将逡逑仍化２基因的ｍＲＮＡ表达水平干扰掉８０％左右，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现在蛋白水逡逑平上也表现出良好的干扰效果（图７Ａ和Ｂ）并且包装成慢病毒后具有感染活性（图逡逑７Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑！１．２逦参逡逑｜。８邋W邋／邋／逡逑教■逦／／／逡逑占邋０．２，逦■占逡逑至邋0１逦１—Ｍ－邋一邋Ｈｇｉｎ邋ＧＡ阳Ｈ逡逑／邋／逡逑■国逡逑图７．筛选有效的ｓｈＲＮＡ序列并包装成慢病毒逡逑用ｐＬＵ．７空质粒或者重组Ｗ后的ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２质粒与过表达质粒Ｍｙｃ－Ｐｒｒｔ２同时转逡逑染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，（Ａ）４８ｈ后提取细胞总ｍＲＮＡ，，通过Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＰＣ民检测转入逡逑ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２质粒的干扰组与转入空载体的对照组之间Ａｒｃ基因ｍＲＮＡ相对表达逡逑水平的差异，ＧＡＰＤＨ为内参基因（统计结果均表示为平均值±标准差，ｎ邋＝邋３）；邋（Ｂ）逡逑４８邋ｈ后提取细胞总蛋白，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测转入ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２质粒的干扰组与转逡逑５８逡逑
被感染的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞在激发光下会发出绿色巧光，标尺为１００邋＾ｍｉ。＊＊，Ｐ＜邋０．０１。逡逑接下来培养Ｅ１８．５胎鼠的大脑皮层神经元，并用ａｎｔｉ－ＭＡＰ２抗体进斤免疫巧光逡逑实验，鉴定所培养的细胞确实是神经元细胞，如图８所示，绿色巧光显示被ＭＡＰ２逡逑抗体标记的神经元树突。逡逑ＭＡＰ２逦ＤＡＰＩ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑图８．鉴定原代培养大脑皮层神经元逡逑培养到第８天的神经元进行免疫巧光us示被ａｎｔｉ－ＭＡＰ２抗体标记的神经元树突，逡逑ＭＡＰ２—抗１：２００稀释，标尺为５０邋［ｊｍ。逡逑３．２邋Ｐｒｒｔ２表达被敲低后小鼠神经元培养基中谷氨酸含量X椂噱义纤淙荒约挂汉脱褐溆醒郧烧希欢ǔ潭壬献璋舜蟛糠治镏实淖杂闪麇义隙窃缇陀醒芯糠⑾帜约挂褐泄劝彼岬呐ǘ群脱褐泄劝彼岬呐ǘ却嬖谡喙劐义嫌纱送撇猓校耍貌∪搜逯衆鏊降男朔苄月然峥赡芊从沉似淠约挂褐行朔苠义闲园被岷恳财撸钪盏贾铝舜竽缘敝猩窬男朔苄怨摺Ｎ搜橹ふ飧黾馘义仙瑁直鹩枚哉章《竞停螅瑁遥危粒校颍颍簦仓刈槁《靖腥酒げ闵窬缓笫占嘌义匣锨澹酶咝б合嗌追治黾觳馀嘌腥职被岬暮俊Ｍ碧崛「腥竞笊皴义暇淖艿鞍准觳猓螅瑁遥危谅《靖扇牛校颍颍簦驳鞍妆泶锏男
本文编号：2581953
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