miRNA-210在急性脑梗死中的作用及其相关机制研究

发布时间：2020-03-18 01:20

【摘要】：目的:1、比较mi RNA-210在急性脑梗死(ACI)患者及健康人群血清中的表达差异;2、评估血清中mi RNA-210表达水平在ACI患者的诊断和预后预测中的作用以及与患者血清中炎症因子水平的相关性;3、探讨ACI患者血清对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)mi RNA-210表达的影响;4、研究mi RNA-210对HUVECs细胞增殖与凋亡的影响;5、研究mi RNA-210对HUVECs细胞中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA和蛋白水平表达的调控;6,建立大鼠大脑中脑动脉闭塞(MCAO)模型,研究mi RNA-210在MCAO模型大鼠血清和脑组织中的表达水平及其相关性;7、检测MCAO大鼠模型血清和脑组织中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA水平的表达,以及脑组织中Hes1、Notch1、VEGF在蛋白水平表达情况,研究mi RNA-210表达对大鼠急性脑梗死的调控机制。方法:1,选取2016年1月至2016年12月泰州市人民医院急诊科接诊的ACI患者70例,同时纳入40例正常体检者作为健康对照组。采用荧光实时定量反转录聚合酶链反应(RT-q PCR)法检测ACI患者和健康对照组血清中mi RNA-210表达水平并进行统计学分析。建立受试者工作曲线(ROC)评估血清mi RNA-210表达水平对ACI的诊断价值。2、应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法分别检测血清炎症因子C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)及降钙素原(PCT)水平。计算患者入院后美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。研究患者血清中mi RNA-210表达与炎症因子水平及NIHSS评分的相关性。3、ACI患者发病后第30天参照格拉斯哥预后评分(GOS)标准进行预后分析,系统评价mi RNA-210以及炎症因子在评估ACI疾病预后中的价值。4、收集ACI患者及健康人血清,通过RT-q PCR法检测比较患者血清培养组、健康人血清培养组和空白对照组三组HUVECs细胞中mi RNA-210含量,并进行统计学分析。5、应用CCK8细胞增殖实验和Annexin V-PI双染法及流式细胞术分析转染mi RNA-210模拟物组(mi RNA-210组)、转染模拟物阴性对照组(NC组)和未转染组(Control组)三组HUVECs细胞增殖和凋亡情况,评价mi RNA-210对HUVECs细胞增殖和凋亡的影响。6、通过RT-q PCR、Western blot方法检测mi RNA-210组、NC组和Control组HUVECs中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达,并进行统计学分析。7、选取健康SD大鼠22只,随机分为MCAO模型组12只和正常对照组10只,采取线栓法构建大鼠MCAO模型并进行神经系统功能评分。其中1只MCAO大鼠行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑组织梗死情况,取另1只MCAO大鼠进行苏木精-伊红染色法(HE)染色,显微镜下观察神经细胞形态变化情况。8、采用RT-q PCR法分别检测MCAO模型大鼠和正常对照组大鼠各10只血清和脑组织中mi RNA-210表达水平,并进行统计学分析。9、应用RT-q PCR和Western blot法检测MCAO模型大鼠和正常对照组大鼠血清中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平的表达和脑组织中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA及蛋白水平的表达,并进行统计学分析。结果:1,ACI患者血清中mi RNA-210水平与健康对照组相比明显上调(P0.05)。ROC曲线分析结果显示,mi RNA-210的曲线下面积(AUC)为0.942,95%置信区间(CI)为0.898~0.986,最优割点为1.6,而切点的敏感性和特异性分别为82.86%和97.50%。2,ACI患者血清中mi RNA-210水平与GOS预后评分成正相关,和NIHSS评分成负相关;与健康对照组相比,ACI患者血清CRP、IL6及NGAL水平升高(P0.05),但与GOS预后评分和NIHSS评分无相关性。3,ACI患者血清培养HUVECs后,与健康人血清培养组和空白对照组相比,HUVECs中mi RNA-210表达显著上调(P0.01)。4,CCK8细胞增殖实验中,mi RNA-210组较NC组和Control组,培养48h后HUVECs的细胞增殖率上升(P0.05),培养72h后HUVECs的细胞增殖率显著上升(P0.01)。培养48h后,对细胞进行Annexin V-PI双染,流式细胞仪分析显示:mi RNA-210组较NC组及Control组,HUVECs细胞凋亡率显著下降(P0.01)。5,应用RT-q PCR、Western blot方法检测mi RNA-210组HUVECs细胞中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平表达结果显示:mi RNA-210组中Hes1和VEGF在m RNA水平表达增加,与另外两组对比具有统计学差异(P0.01),而Notch1表达与另外两组相比,无统计学差异(P0.05);Hes1,Notch1和VEGF蛋白水平表达mi RNA-210组与其余两组比较均显著上调,具有统计学差异(P0.01)。6,TTC染色后可见MCAO大鼠模型中脑组织梗死侧中明显梗死病灶。HE染色后显微镜下可见MCAO模型梗死病灶组织中大量神经细胞核浓缩凋亡,而健侧脑组织见少许凋亡细胞。7,应用RT-q PCR法检测MCAO大鼠模型血清和脑组织中mi RNA-210表达水平,结果发现MCAO模型大鼠脑组织及血清组织中mi RNA-210表达水平较正常对照组明显上调,且血清和脑组织中mi RNA-210的表达具有相关性,具有统计学差异。8,应用RT-q PCR、Western blot方法检测MCAO大鼠模型血清和脑组织中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达,结果发现MCAO大鼠模型血清及脑组织中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平较正常对照组大鼠均上调;脑组织中Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平较正常对照组大鼠亦上调。均具有统计学差异。结论:1,在ACI患者中,血清mi RNA-210有潜力成为ACI诊断和预后预测的生物学标志物;炎症因子CRP、IL-6、NGAL水平在ACI早期升高,但与ACI患者神经系统损伤程度和预后不相关。2,ACI患者血清环境能够提高HUVECs细胞中mi RNA-210的表达;通过细胞实验研究发现:mi RNA-210在ACI中的调控机制可能与调节血管内皮细胞的增殖和凋亡以及上调Hes1、VEGF在m RNA表达和上调Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平的表达相关;3,成功构建大鼠MCAO模型,MCAO大鼠血清和脑组织中mi RNA-210的表达水平均升高,在动物模型中再次验证mi RNA-210可能通过上调Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达,从而参与ACI的调控机制。
【图文】：

栓塞,血管,颈总动脉,颈外动脉

给予碘伏消毒后，取颈部正中切口，逐层切开用弯头止血钳钝性分离周围组织及腺体，充分分离，触及动脉搏动后，逐步分离右侧颈动脉分离，辨别颈动脉鞘内右侧颈总动脉(CCA)脉(ICA)等解剖结构。小心剥开并轻轻提起颈。同样分离剥开并用细线将右侧颈总动脉提起动脉夹将颈总动脉阻断后，将右侧颈总动脉在夹。在颈外动脉壁剪一斜角切口，插入准备好外动脉经颈内动脉到达大脑中动脉开口处，线当回缩后调整角度再行插入，线栓插入深度大栓栓塞完成后，一起结扎右侧颈外动脉和线栓进一步清创，缝合切口。待大鼠清醒。术毕

表达水平,健康人,急性脑梗死,细胞

-210 在急性脑梗死中的作用及其相关机制研究期的 HUVECs 细胞，，提取各组总 RNA，反转录成 cDNA 后， HUVECs 细胞中的 miRNA-210 表达水平进行检测。结果显示UVECs 细胞中 miRNA-210 表达水平显著增高，与健康人血清比具有统计学差异（P＜0.01），见图 10。可见急性脑梗死患iRNA-210 的表达。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

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