Kv1.3通道阻断剂ImKTx88对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的作用和机制研究

发布时间：2020-03-19 18:35

【摘要】：背景:多发性硬化(multiple sclersosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病,特征性病理改变包括炎性细胞浸润、髓鞘结构破坏、轴索损伤和胶质细胞增生。近年来临床上主要采用免疫抑制剂治疗MS,已取得一定短期疗效,但长期治疗效果仍然不佳。尽管大部分免疫抑制剂能够抑制免疫系统对CNS的攻击,但对已发生的神经损伤却未能有效修复,导致病情进行性加重。研究表明,钾离子Kv1.3通道在MS中的表达大量增加,Kv1.3通道已成为治疗MS的潜在靶点。Kv1.3电压门控钾通道是Kv1.x亚家族中的一员,存在于免疫细胞和神经细胞胞膜上,对调节免疫细胞和神经细胞的生理功能起着重要作用。T细胞受到自身抗原的反复激活后,穿过血脑屏障,引起CNS炎症反应,是MS形成的重要原因之一。在此过程中,T细胞Kv1.3通道的表达大量增加。虽然已有研究证实Kv1.3通道阻断剂可以缓解MS大鼠模型的发病症状,但是Kv1.3通道阻断剂的研究大多集中在抑制T细胞介导的炎性反应上,对其参与中枢神经保护和调节其它免疫细胞功能方面的研究较少。小胶质细胞作为CNS固有免疫细胞也参与了 MS的发生发展,在MS中,小胶质细胞被激活并伴随Kv1.3通道表达显著增加,但小胶质细胞炎性活化与Kv1.3通道表达变化的关联和具体机制仍不明确。前期工作中,我们筛选出了一种高效特异性的Kv1.3通道阻断剂ImKTx88,本课题将研究其在MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠中的神经保护作用,并进一步探讨ImKTx88抑制小胶质细胞炎性活化,减轻神经细胞损伤的效应和分子机制,为MS的治疗提供理论与实验依据。目的:研究Kv1.3阻断剂ImKTx88在EAE大鼠中的神经保护作用,并揭示ImKTx88是如何通过抑制小胶质细胞炎性活化,进而减轻其损伤神经细胞的潜在机制。方法:(1)将脑脊髓匀浆于第0天和第7天两次免疫SD大鼠建立EAE模型。大鼠被随机分为对照组、EAE组和ImKTx88治疗组。第12天,按照100 μg/kg的剂量每天皮下注射ImKTx88(治疗组)或同等体积的PBS(对照组和EAE组)。采用双盲法观察并记录各组大鼠行为学评分。第23天处死动物收集脊髓组织。(2)取腰骶部脊髓组织制成石蜡组织切片,采用免疫组化染色观察白质区域少突胶质细胞丢失、神经轴索损伤和炎性细胞浸润情况。对早期分化阶段少突胶质细胞(NG2)、中晚期分化阶段少突胶质细胞(CC-1)和成熟少突胶质细胞(MBP)进行免疫组化染色观察髓鞘细胞丢失情况;对神经轴索进行神经丝蛋白NF200和β-淀粉样前体蛋白APP染色观察神经轴索损伤情况;对T淋巴细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞和小胶质细胞分别进行CD3、GFAP、MPO、CD68/Iba-1免疫组化染色观察它们在脊髓中的浸润情况。双重免疫荧光标记CD68和Kv1.3检测各组大鼠脊髓组织中活化的小胶质细胞Kv1.3通道的表达。(3)对各组大鼠脊髓组织进行LFB染色,观察脊髓白质脱髓鞘程度;透射电镜超微结构分析各组大鼠脊髓白质中的髓鞘和神经轴索结构。(4)通过ELISA方法检测各组大鼠脊髓组织匀浆中促炎细胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-α和IL-6)的含量。采用LPS、LPS+不同浓度ImKTx88处理BV2小胶质细胞,ELISA检测细胞培养上清中TNF-α和IL-6的含量。(5)采用LPS、LPS+不同浓度的ImKTx88分别处理BV2小胶质细胞,取细胞培养上清分别与原代纯化培养的少突胶质细胞和神经元孵育24 h,CCK8检测少突胶质细胞和神经元的生存以及TUNEL染色检测少突胶质细胞和神经元的凋亡情况。(6)qPCR、Wetern blot和免疫细胞荧光检测对照组、LPS组和LPS+不同浓度ImKTx88组中BV2小胶质细胞Kv1.3通道的表达。Western blot检测各组BV2小胶质细胞中信号通路关键分子MyD88、TRAF6和p65蛋白的表达。结果:(1)对照组大鼠在整个实验过程中无发病症状,EAE组大鼠从第一次免疫后第12天开始出现肢体瘫痪症状,且进行性加重,而ImKTx88治疗显著缓解EAE大鼠发病症状,降低行为学评分。(2)免疫组化标记不同分化阶段的少突胶质细胞结果显示:EAE组中,NG2、CC-1和MBP阳性细胞数量较对照组显著降低,而ImKTx88治疗组中,上述阳性细胞数量较EAE组均明显增加。(3)免疫组化标记神经轴索和电镜超微结构分析神经纤维结果显示:EAE组NF200的表达较对照组明显降低,β-APP在病灶区表达显著提高。ImKTx88治疗组NF200的表达明显提高,β-APP在病灶区的表达显著降低。电镜观察神经纤维超微结构显示,EAE组中神经轴索密度、髓鞘厚度显著降低,而G-ratio值显著升高。ImKTx88治疗组中神经轴索密度、髓鞘厚度明显增加,G-ratio值显著降低。结果提示,ImKTx88减少EAE大鼠髓鞘细胞和神经轴索的丢失与破坏。(4)免疫组化标记脊髓中的炎性细胞和ELISA检测促炎细胞因子含量的结果显示:EAE组中浸润的CD3、GFAP、MPO和CD68/Iba-1阳性细胞的数量与对照组相比显著增加,而ImKTx88治疗组与EAE组相比,上述炎性细胞数量明显降低。ELISA结果显示:EAE组大鼠脊髓中促炎细胞炎性因子IL-6、TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量与对照组相比显著升高,而ImKTx88治疗组与EAE组相比,上述促炎细胞因子的含量明显降低。结果提示,ImKTx88能够抑制EAE大鼠的CNS炎性反应。(5)双重免疫荧光标记显示:EAE组脊髓中活化的小胶质细胞Kv1.3通道表达明显升高,而ImKTx88治疗组中小胶质细胞的Kv1.3通道表达显著降低。在细胞学水平上,LPS激活的BV2小胶质细胞中Kv1.3的表达显著升高,给予ImKTx88处理后,Kv1.3通道的表达明显降低。此外,ELISA检测BV2小胶质细胞培养上清促炎细胞因子的结果显示:不同浓度的ImKTx88处理由LPS激活的BV2小胶质细胞24 h后,BV2小胶质细胞培养上清中IL-6和TNF-α的水平明显降低。qPCR结果表明,ImKTx88抑制活化的BV2小胶质细胞IL-6和TNF-α的转录。同时,CCK8和TUNEL染色的结果表明,ImKTx88抑制炎性上清损伤少突胶质细胞和神经元产生的凋亡。(6)Western blot检测BV2小胶质细胞中信号通路蛋白表达的结果显示:LPS组与对照组相比,MyD88、TRAF6和p-p65蛋白表达显著升高,而LPS+ImKTx88组与LPS组相比,上述蛋白的表达明显降低。结果提示,ImKTx88可能通过阻断MyD88/TRAF/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的活化。结论:本研究发现Kv1.3通道阻断剂ImKTx88能够缓解EAE大鼠发病症状,抑制炎性反应,减轻髓鞘丢失和神经轴索损伤。研究进一步证实,ImKTx88通过抑制Kv1.3通道降低BV2小胶质细胞的活化,减轻BV2小胶质细胞炎性活化导致的神经细胞损伤,其作用机制可能是通过下调小胶质细胞中的MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路抑制其炎性活化。以上研究提示Kv1.3通道阻断剂ImKTx88对于MS的临床治疗具有潜在的应用前景。
【图文】：

脱髓鞘,髓鞘,细胞的,程度

而ＩｍＫＴｘ８８治疗组评分均值为１．２５分，与ＥＡＥ组相比显著降低（Ｐ＜０．０５邋）。逡逑随后，我们通过ＮＧ２、ＣＣ－１和ＭＢＰ免疫组化染色观察脊髓白质区域各分化阶逡逑段的少突胶质细胞（图１．Ｂ－Ｄ）。结果显示，ＥＡＥ组大鼠ＮＧ２、ＣＣ－１阳性细胞较逡逑对照组相比显著减少（尸＜０．０１）；对照组大鼠ＭＢＰ染色显示无脱髓鞘。ＩｍＫＴｘ８８逡逑治疗组血管周围ＮＧ２阳性细胞、ＣＣ－１阳性细胞和ＭＢＰ阳性面积和ＥＡＥ组相比逡逑明显增加（Ｐ＜０．０５）。以上结果表明，ＩｍＫＴｘ８８治疗能够显著降低ＥＡＥ大鼠脊髓逡逑脱髓鞘程度和髓鞘细胞的丢失，从而起到髓鞘保护作用。逡逑１７逡逑

白质,轴索损伤,缺失表达,脱髓鞘病

和ＡＰＰ免疫组化染色。在对照组中，白质区域轴索成规则排列，，ＮＦ２００阳性信逡逑号分布均匀，而在ＥＡＥ组中，白质严重损伤区域ＮＦ２００着色较浅或缺失表达。逡逑ＩｍＫＴｘ８８治疗组中可见轴索损伤的范围和程度明显减轻（图２Ａ）。通过对各组逡逑ＮＦ２００表达进行平均光密度（ｍｅａｎ邋ｏｐｔｉｃａｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ，邋ＭＯＤ）分析发现，ＩｍＫＴｘ８８逡逑治疗组较ＥＡＥ组ＮＦ２００邋ＭＯＤ值显著提高（尸＜０．０１邋）。对照组中ＡＰＰ呈阴性表达，逡逑ＥＡＥ组脱髓鞘病灶中，ＡＰＰ大量表达（图２Ｂ），而ＩｍＫＴｘ８８治疗组较ＥＡＥ组逡逑ＡＰＰ表达显著降低（Ｐ０．００１）。逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.51

【相似文献】