GPR30下调参与缺血性脑卒中后雌激素神经保护作用减弱的作用及机制研究

发布时间：2020-03-20 00:00

【摘要】：雌激素和其膜受体GPR30(G蛋白偶联受体)已被证明在脑缺血性中风和脑退行性疾病中发挥了重要的神经保护作用。然而长期剥夺雌激素后,雌激素神经保护作用减弱的机制目前仍不明确。其可能的机制包括:海马区雌激素α受体的表达下降导致雌激素敏感性的下降,神经元的主要能量来源由葡萄糖转变为酮体导致神经元的ATP下降,以及胆碱乙酰转氨酶的活性下降导致乙酰胆碱的合成减少。本研究主要探讨了在雌激素关键期假设中,GPR30在雌激素神经保护作用减弱中所起的作用及其机制。雌激素关键期假设是指雌激素应该在妇女绝经前或绝经后立即给予治疗,如果在绝经后很长时间后再给予治疗,其神经保护作用会严重的减弱甚至消失。本研究通过构建大鼠卵巢切除模型和四脑血管阻断全脑缺血模型,验证了雌激素或GPR30特异性激动剂G1在短期雌激素剥夺后全脑缺血模型中的神经保护作用,同时也发现了雌激素或G1在长期雌激素剥夺后全脑缺血模型中却未能发挥明显的神经保护作用。本研究首先对比短期和长期雌激素剥夺后海马CA1区GPR30的表达差异,通过在体实验揭示了GPR30下调的可能机制;然后通过在体实验验证对长期雌激素剥夺的大鼠,立即给予雌激素替代治疗10周可以抑制GPR30的下调,并发挥神经保护作用;最后在老年雌性大鼠上也验证了GPR30表达下调的机制。本研究通过对雌激素膜受体GPR30的研究,进一步阐述了在雌激素关键期假设中雌激素神经保护作用减弱的机制,同时也为临床上绝经期妇女脑缺血神经损伤的预防和治疗提供了新的治疗靶点和干预策略。本研究具体分为3部分:第一部分:雌二醇和G1激动剂对短期和长期雌激素剥夺大鼠的神经保护作用研究目的:成功构建雌性SD大鼠卵巢切除模型和四脑血管阻断全脑全血模型,观察E2和G1在短期和长期雌激素剥夺大鼠上是否具有同样的神经保护作用。实验方法:(1)将成年雌性SD大鼠随机分为四组:假手术组1、卵巢切除1周组、假手术组2、卵巢切除10周组。对假手术组只进行手术分离不切除卵巢组织,对卵巢切除组行双侧卵巢切除术,假手术组1和卵巢切除1周组于1周后尾尖采血测定雌二醇浓度,假手术组2和卵巢切除10周组于10周后尾尖采血测定雌二醇浓度。(2)将成年雌性SD大鼠随机分为三组:假手术组、全脑缺血10分钟组和全脑缺血20分钟组。对假手术组只进行手术分离不阻断四血管,对缺血组行双侧椎动脉电凝剪断及24小时后双侧颈总动脉阻断10分钟和20分钟,分别观察3组大鼠海马区神经元损伤情况。(3)对短期雌激素剥夺大鼠(双侧卵巢切除1周)和长期雌激素剥夺大鼠(双侧卵巢切除10周)分别分为四组:假手术组、安慰剂组、雌二醇组和G1组,行全脑缺血模型后对脑切片行尼氏染色,对比四组间海马区神经元损伤情况。实验结果:(1)通过对比假手术组1和卵巢切除1周组术后第1、3、5、7天血清雌二醇浓度,可以发现卵巢切除1周组与假手术组相比血清雌二醇浓度迅速下降,术后第7天雌二醇浓度低于5 pg/mL。通过对比假手术组2和卵巢切除10周组术后第1、3、5、10周血清雌二醇浓度,可以发现卵巢切除10周组与假手术组相比血清雌二醇浓度迅速下降,术后第10周血清雌二醇浓度低于1 pg/mL。(2)与假手术组相比,全脑缺血10分钟组海马CA1区出现明显的神经元损伤,椎体细胞损伤严重,数量显著减少,神经元核固缩。全脑缺血20分钟组神经元损伤较全脑缺血10分钟组更加严重,大部分细胞正常结构消失,核浆溶解,大部分细胞尼氏小体缺失,仅残存少量形态完整的神经元。(3)E2或G1在短期雌激素剥夺的大鼠发挥了显著的神经保护作用,有效地减少了海马区神经元的损伤,但在长期雌激素剥夺的大鼠中的保护作用并不明显。结论:该部分研究明确了卵巢去势模型可以显著降低血雌二醇水平,同时全脑缺血大鼠模型会导致海马区神经元的明显损伤;进一步发现E2或G1可以有效减少短期雌激素剥夺大鼠海马神经元损伤,发挥了显著的神经保护作用,而对长期雌激素剥夺大鼠的神经保护作用并不明显。第二部分:GPR30在雌激素“关键期”假设中神经保护作用减弱的机制研究研究目的:探讨GPR30在雌性大鼠长期雌激素剥夺后雌激素神经保护减弱的作用,以及GPR30表达下调的机制研究。实验方法:(1)将成年雌性SD大鼠随机分为假手术组、短期雌激素剥夺组和长期雌激素剥夺组。免疫荧光染色检测三组大鼠海马区GPR30的表达情况,Western blot检测三组大鼠海马CA1区GPR30的蛋白表达水平。(2)实时定量PCR(qPCR)检测假手术组、短期雌激素剥夺组和长期雌激素剥夺组大鼠GPR30的mRNA水平,免疫共沉淀检测三组海马CA1区GPR30的泛素化水平。(3)将卵巢切除10周后给予雌二醇或安慰剂替代治疗的大鼠和卵巢切除后立即给予雌二醇或安慰剂替代治疗10周的大鼠分别随机分为3组:空白对照组、安慰剂组和雌二醇组,对其断头取脑分离海马CA1区组织,提取蛋白质和RNA,分别行Western blot和qPCR检测。(4)将卵巢切除10周后给予雌二醇或安慰剂替代治疗的大鼠和卵巢切除后立即给予雌二醇或安慰剂替代治疗10周的大鼠分别随机分为5组:假手术组、安慰剂组、雌二醇组、雌二醇+G15组和G15组,行全脑缺血模型后对脑切片行尼氏染色对比5组间海马CA1区神经元损伤情况。(5)将卵巢切除10周后给予雌二醇或安慰剂替代治疗的大鼠和卵巢切除后立即给予雌二醇或安慰剂替代治疗10周的大鼠分别随机分为3组:假手术组、安慰剂组和雌二醇组,对脑切片行TUNEL染色对比3组间神经元凋亡情况。实验结果:(1)免疫荧光染色显示GPR30在短期雌激素剥夺组海马CA1区表达轻度下降,而在长期雌激素剥夺组海马CA1区表达显著下降;Western blot显示长期雌激素剥夺组海马CA1区GPR30含量与短期雌激素剥夺组海马CA1区相比明显下降。(2)免疫共沉淀显示假手术组、短期雌激素剥夺组和长期雌激素剥夺组GPR30在海马CA1区泛素化程度无显著差别。qPCR显示长期雌激素剥夺组GPR30在海马CA1区mRNA水平较短期雌激素剥夺组显著降低。(3)对雌性大鼠卵巢切除10周后给予雌二醇治疗并不能抑制海马CA1区GPR30的下调,且在全脑缺血模型中不能有效减少海马区神经元的损伤。而对雌性大鼠卵巢切除后,立即给予雌二醇治疗10周可显著抑制海马CA1区GPR30蛋白和mRNA水平的下调,同时在全脑缺血模型中能有效减少海马区神经元的损伤,但给予G15可阻断雌激素的这种神经保护作用。(4)Tunel染色显示卵巢切除后,立即给予雌二醇替代治疗10周的大鼠海马CA1区神经元凋亡数量明显减少,而卵巢切除10周后给予雌二醇替代治疗的大鼠海马CA1区大部分神经元发生明显的凋亡。结论:长期雌激素剥夺大鼠海马CA1区GPR30蛋白表达显著下调,且GPR30蛋白水平的下降主要是由于其mRNA水平下降引起。对雌性大鼠行双侧卵巢切除后,立即给予雌二醇替代治疗10周可抑制大鼠海马CA1区GPR30蛋白和mRNA水平的下调,同时对大鼠行全脑缺血模型后能发挥显著神经保护作用,但这种保护作用可被GPR30特异性拮抗剂G15所阻断。第三部分:GPR30在老年雌性大鼠海马区的表达及E2和G1对老年雌性大鼠是否发挥神经保护作用的机制研究研究目的:明确GPR30在老年雌性大鼠海马CA1区表达是否发生下调及其机制,以及E2和G1对老年雌性大鼠是否发挥了神经保护作用。实验方法:(1)将雌性大鼠分为青年雌性大鼠组(3个月)和老年雌性大鼠组(24个月),Western blot检测雌二醇的核受体雌激素α、雌激素β和膜受体GPR30在两组大鼠海马CA1区的表达情况。(2)qPCR和免疫共沉淀检测两组大鼠海马CA1区mRNA转录水平和泛素化降解水平。(3)将老年雌性大鼠随机分为四组:假手术组、安慰剂组、雌二醇组和G1组,行全脑缺血模型后对其断头取脑制作海马区切片,行尼氏染色和TUNEL染色对比四组间神经元存活情况。实验结果:(1)Western blot结果显示在老年雌性大鼠组海马CA1区雌激素α、雌激素β和GPR30受体与青年雌性大鼠组相比均发生明显下调。(2)qPCR显示老年雌性大鼠组mRNA转录水平下降到年轻雌性大鼠组的50%,而免疫共沉淀显示两组间的泛素化降解水平无明显差异。(3)对老年雌性大鼠组行全脑缺血模型后尼氏染色和TUNEL染色结果显示雌二醇和G1在老年雌性大鼠海马CA1区均未发挥明显的神经保护作用。结论:进一步证明了GPR30在老年雌性大鼠中表达下降,且GPR30的下降主要是由于mRNA水平的下降引起。给予老年雌性大鼠E2或G1治疗并不能发挥明显的神经保护作用。
【图文】：

神经保护作用,雌激素,机制,雌二醇

图 1 雌激素神经保护作用的机制2.2.1 雌激素受体 α（ERα）在脑缺血雌激素发挥的神经保护作用中是关键的调节剂起初表明雌激素受体在脑缺血中调节雌二醇神经保护的证据来源于雌激素受体α 和 β 的拮抗剂，当在全脑缺血前同时给予雌二醇和雌激素受体 α 和 β 拮抗剂-ICI182,780，ICI182,780 阻止了雌二醇的保护效应[31]。而且，基因改良的小鼠表明雌激素受体 α 在脑卒中中是雌二醇发挥神经保护作用主要的调节剂。卵巢切除的雌激素受体 α 敲除的小鼠在缺血前给予雌二醇治疗其雌二醇神经保护作用完全消失。但卵巢切除的雌激素受体 β 敲除的小鼠在缺血前给予雌二醇治疗其雌二醇神经保护作用仍存在[32,33]。此外，用反义引物寡核苷酸同时敲除雌激素 α 受体和 β 受体，证明雌激素 α 受体而不是 β 受体调节全脑缺血的雌二醇神经保护作用[20]。双侧脑室注射雌激素 α 受体和 β 受体反义引物寡核苷酸每 24 小时连续 4 天会导致海马 CA1 区雌激素 α 受体和 β 受体蛋白水平的下降。错义的寡核苷酸在雌激素 α 受体和 β 受体

胆碱乙酰转移酶,雌二醇,雌激素,神经递质

5.2 动物实验的支持大量的动物研究为关键期假设提供了支持，也为长期剥夺雌激素后的神经系统的结果提供了机制证据（图 2）[82,99]。事实上，卵巢切除术是一个手术绝经模型，，在猕猴上导致了海马区对雌激素反应的严重下降[71]。当双侧卵巢切除后雌二醇马上开始治疗而不是 5 月后开始治疗，中年雌性大鼠的研究也表明在操作和记忆上的改善[100]。在双侧卵巢切除的中年雌性大鼠上，长期雌二醇治疗被发现增加了注意执行功能，而长期剥夺雌激素减弱了这种功能[101]。同样地，在成年年轻大鼠卵巢切除后雌二醇替代治疗一直到 15 个月，发现增加了长期注意力和在海马 CA3-CA1 区突触的树突棘密度，这两个进程对学习和记忆都是关键的。然而，如果雌二醇被延迟到卵巢切除后19个月治疗，雌二醇在海马区突触的有利效应消失了，表明雌二醇替代治疗的关键期。而且，研究者观察到雌激素被剥夺 5 个月后的大鼠消除了雌二醇在海马 CA1 区神经元调节内膜应激性的能力[102]。事实上，动作电位发生的数量和每次雌二醇注射的发放时程在长期雌激素剥夺的神经元上与对照组相比也减少了。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

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