血清外泌体miRNAs在急性脑梗死诊断中的应用研究

发布时间：2020-03-22 07:52

【摘要】：目的通过检测急性缺血性卒中(AIS)患者的血清外泌体浓度和两种脑特异性微小RNA(miRNA),miR-9和miR-124的表达水平,探讨其用于AIS诊断及损伤评估的预测价值。方法1.选择2014年9月至2015年8月期间收住入院的65名AIS患者(发病时间72h)与同期在我院进行体检的66名非卒中志愿者,采用ExoQuick试剂盒方案提取两组血清中的外泌体,通过透射电子显微镜,纳米粒子跟踪分析和免疫印迹(Western blot)鉴定血清外泌体的存在。使用实时定量PCR的方法测定血清外泌体miR-9和miR-124的表达水平。2.收集入组者年龄、性别、高血压、糖尿病、房颤、高脂血症等临床资料及梗死体积、NIHSS评分及IL-6的值,探讨miR-9、miR-124与梗死体积、NIHSS评分及IL-6的相关性。3.通过ROC曲线分析血清外泌体miR-9和miR-124对于AIS的诊断价值。结果1.AIS患者血清外泌体的miR-9和miR-124的表达水平与对照组相比显著升高,且差别有统计学意义(p0.01)。2.AIS患者血清外泌体的miR-9和miR-124表达水平与美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS评分)、梗死体积及血清炎症因子IL-6呈正相关,且均有统计学意义(p0.01)。3.血清外泌体miR-9和miR-124在ROC曲线下面积分别为0.8026和0.6976。结论miR-9和miR-124有潜力成为诊断AIS及评估缺血损伤程度的生物标志物,为探讨AIS患者预后的生物标志物提供了新的思路。
【图文】：

南通大学硕士学位论文 第三章 结 果到外泌体的存在。针对 CD81 的抗体我们探测到 26kDa 条带，也是 CD81 的预期分子量，CD9 和 CD63 我们也发现了类似的结果（图 1D）。总之，获得的微泡呈现了外泌体的主要特征，并且在后续的实验中我们也使用这种分离方法提取血清外泌体。

图 2. AIS 组和对照组血清外泌体的浓度比较我们通过 qPCR 的方法检测血清外泌体中 miR-9 和 miR-124 的相对表达量。由于缺乏适用于循环外泌体 miRNA 研究中的归一化控制的管家基因，我们建立的工作流程确保从不同实验和个人获得的 PCR 数据具有可比性。首先，从相同体积血清（250μl）提取而来的外泌体中提取总 RNA，并在相同体积的不含 Rnase的水中洗脱。然后将相同体积的 RNA 溶液进行 poly（A）尾部的 3’延伸并随后进行逆转录和 qPCR。加入 25fmol 的 Cel-miR-39 作为外参并进行数据归一化。miR-451 是一种大量存在于红细胞中的 miRNA，在前期实验中，我们确定了miR-451 的稳定性，故将其作为内参。如图 3A 和 3B 所示，与对照组相比，卒中组 miR-9 和 miR-124 的水平均显著增加（p <0.01）。由于 miR-9 和 miR-124 在卒中组的中位 Cq 值分别比对照组低约 4 个和 2 个周期，故 miR-9 的变化较 miR-124 的变化更为明显，AIS 患者miR-9 和 miR-124 比健康者分别增加 16 和 4 倍。在外泌体 miR-451 的表达水平在两组中无显著差异（p> 0.1）（图 3C）。
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

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