杨梅黄酮保护鱼藤酮造成的MES23.5细胞损伤的机制探讨

发布时间：2020-03-22 10:20

【摘要】：帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年人的神经退行性疾病,以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现,其病理学特征为中脑黑质致密带(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性缺失。目前,PD的发病机制尚不明确,但普遍认为与遗传因素以及氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡、环境因素和铁聚积等非遗传因素有关。研究证明,黑质(substantia nigra,SN)铁的聚积是导致DA损伤的重要原因,因此,维持细胞铁稳态对控制疾病的发生发展尤为重要。铁调素(Hepcidin)是近年来发现的能够调节细胞铁离子浓度的激素样物质,对维持机体铁稳态起着重要的作用。当机体处于缺铁状态时,激活的hepcidin促进了小肠铁的摄取,增加细胞的铁含量;相反,当机体铁含量升高时,hepcidin减少,减弱了过量的铁对细胞的损伤。Hepcidin的生理功能是与细胞膜上的铁转出蛋白ferroportin1(Fpn1)结合,使Fpn1发生内化降解,减少膜上的Fpn1从而抑制铁的外排。因此,hepcidin表达升高可造成细胞内铁聚积,没有外排的铁离子在细胞内通过Fenton反应,刺激氧化应激的发生从而对细胞产生不可逆的损伤。目前,临床上并没有真正成熟有效的药物来阻止或者逆转PD发病过程中细胞的损伤和死亡,因此,寻找高效、低毒、副作用小的抗PD临床药物成为现在新的研究热点。杨梅黄酮(Myricetin)是提取于杨梅枝叶以及树皮的天然黄酮类化合物。如今,黄酮类化合物的抗氧化、抗炎症、抗癌症作用引起了人们的广泛关注。前期研究中,杨梅黄酮已被证明具有一定的神经保护作用,其机制可能与抗氧化、抗凋亡有关。在动物实验中,杨梅黄酮可以拮抗慢性应激引起的抑郁行为以及学习与记忆功能减退,但是其确切的保护机制尚不明确。有研究表明,杨梅黄酮可抑制hepcidin的表达,而hepcidin的分泌可以导致细胞铁聚积,提示杨梅黄酮可能通过抑制hepcidin的产生,从而对PD起到保护作用。但是杨梅黄酮对PD的保护作用是否通过抑制hepcidin的生成而实现,其可能的信号转导机制尚不清楚。本实验应用神经毒性药物鱼藤酮损伤多巴胺能MES23.5细胞来制备PD模型,鱼藤酮能够作用于线粒体呼吸链复合体Ⅰ导致细胞的线粒体损伤,进而引起神经元死亡。综合应用细胞培养、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazoliurn,MTT)法、流式细胞分析技术(flow cytometry,FCM)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、激光共聚焦显微镜成像技术、western blot等多项研究方法,探讨杨梅黄酮对鱼藤酮诱导的多巴胺能MES23.5细胞的保护作用。实验结果如下:1.不同浓度的鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h,经MTT检测,400 n M鱼藤酮处理后细胞生存率为66.1%,与对照组相比差异具有显著性(P?0.001)。不同浓度的杨梅黄酮(10~-1111 M-10~-44 M)处理后,与400 nM鱼藤酮相比,其中10~-66 M的杨梅黄酮保护作用最为显著(P?0.001),同时10~-1010 M与10~-55 M的杨梅黄酮的保护作用仅次于10~(-6)M,保护作用具有显著性差异(P?0.01)。在后续实验中,我们选取400 nM的鱼藤酮以及10~-66 M的杨梅黄酮进行实验。2.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,应用荧光剂罗丹明123检测线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,Δψm)。结果显示,与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞线粒体膜电位显著降低,差别具有统计学意义(P?0.001),而10~-66 M的杨梅黄酮保护组可部分逆转这一作用,与鱼藤酮组相比,线粒体膜电位差升高9.4%,差异具有显著性(P?0.01)。3.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,细胞内活性氧(reactive oxide species,ROS)水平升高,是对照组的2.5倍,差异有统计学意义(P?0.001)。10~-66 M的杨梅黄酮处理可部分逆转鱼藤酮对细胞内ROS水平的影响,差异具有统计学意义(P?0.05)。4.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,实时荧光定量PCR测定hepcidin mRNA的表达,结果显示hepcidin m RNA水平与对照组相比上调了1.5倍,差异具有显著性(P?0.001)。而10~-66 M的杨梅黄酮可以部分逆转这一结果,与鱼藤酮组相比,杨梅黄酮处理组mRNA水平下降了39.6%,差异具有显著性(P?0.05)。5.利用荧光染料calcein结合金属离子后荧光淬灭的特性来检测细胞铁转出能力,结果显示,400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后激光共聚焦显微镜显示的荧光强度显著降低,与对照组相比差异具有统计学意义。而10~(-6) M的杨梅黄酮可以部分逆转这一结果,其荧光强度显著增强与鱼藤酮组相比差异具有显著性。6.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,实时荧光定量PCR测定Fpn1 mRNA的表达,结果显示Fpn1 mRNA水平与对照组相比降低了38.3%,差异具有显著性(P?0.001)。而10~(-6) M的杨梅黄酮抑制鱼藤酮引起的Fpn1 mRNA表达的降低,与鱼藤酮组相比,Fpn1 mRNA的表达提高了35.9%,差异具有显著性(P?0.05)。7.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,western blot测定Fpn1的蛋白表达,结果显示,与对照组相比,鱼藤酮组Fpn1的蛋白表达降低了34.7%,差异具有显著性(P?0.01)。而10~(-6) M的杨梅黄酮处理可抑制Fpn1蛋白表达的降低,与鱼藤酮组相比,Fpn1蛋白表达升高了48.3%,差异具有显著性(P?0.05)。8.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,western blot检测p-STAT3的蛋白表达。结果显示,鱼藤酮组的p-STAT3蛋白水平较对照组升高了47.9%,差异具有显著性(P?0.001)。10~(-6) M的杨梅黄酮处理可显著拮抗鱼藤酮引起的p-STAT3蛋白的升高,与鱼藤酮组相比,p-STAT3的蛋白表达下降了28.2%,差异具有显著性(P?0.001)。9.400 nM鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,western blot测定p-SMAD1/5/9的蛋白表达。结果显示,p-SMAD1/5/9的蛋白水平上升42.5%,与对照组相比差异具有显著性(P?0.01)。10~-66 M的杨梅黄酮处理可显著抑制p-SMAD1/5/9的升高,与鱼藤酮组相比,p-SMAD1/5/9的蛋白表达降低了23.2%,差异具有显著性(P?0.05)。以上结果表明,杨梅黄酮对鱼藤酮造成的MES23.5细胞的损伤具有保护作用,其机制可能是通过激活JAK-STAT和BMP-SMAD信号通路,抑制hepcidin表达,增强铁转出相关。另外,杨梅黄酮也可以直接抑制鱼藤酮造成的细胞内ROS的增加,保护细胞线粒体的功能,从而发挥神经保护作用。本研究不仅为杨梅黄酮的神经保护作用机制提供了进一步的实验依据,而且为黄酮类药物的新用途和进一步研发出临床防治PD的新药提供参考。
【图文】：

结果17图1 不同浓度的鱼藤酮和杨梅黄酮对细胞存活率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of rotenone and myricetin on cell viability(A) Effect of different concentrations of rotenone on MES23.5 cells. 400 nM rotenone decreased thecell viability to 66.1% of control (*P 0.05,**P 0.01,***P 0.001, n=6). (B) Effect of differentconcentrations of myricetin on MES23.5 cells (**P<0.01, n=6). (C) The protective effects of differentconcentrations of myricetin on rotenone-induced MES23.5 cells. 400 nM rotenone significantlydecreased cell viability. 10-6M myricetin significantly inhibited this decrease (***P 0.001, comparedwith the control;##P<0.01,##P<0.001, compared with rotenone treatment group; n=6)

青岛大学硕士学位论文梅黄酮拮抗鱼藤酮诱导的 MES23.5 细胞 Δψm 的降低m 在一定程度上可以反映线粒体的功能，当细胞遭受外源刺激时，障碍，，Δψm 下降。400 nM 的鱼藤酮处理 MES23.5 细胞 24 h 后，Δψ组相比具有统计学意义（P 0.001）；10-6M 的杨梅黄酮共处理显著的 MES23.5 细胞 Δψm 的降低（P 0.05）（图 2）。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 刘佳;段春礼;杨慧;;帕金森病发病机制与治疗研究进展[J];生理科学进展;2015年03期

2 王俊;宋宁;徐华敏;姜宏;谢俊霞;;帕金森病中铁与Alpha-突触核蛋白的相互作用[J];生理科学进展;2015年03期

3 牛诗雯;宁波;刘罡;魏景艳;聂广军;;Hepcidin与疾病关系和其临床意义的研究进展[J];生命科学;2012年08期

4 杨秀娟;洪燕龙;阮克锋;冯怡;赵怀彬;高雅;;中药治疗帕金森病临床及升高脑内多巴胺含量的研究进展[J];中药药理与临床;2012年02期

5 常彦忠,段相林,钱忠明;Hepcidin和铁稳态[J];中华内分泌代谢杂志;2003年06期

相关硕士学位论文 前4条

1 王金霞;补充山菠菜多糖对长时间大强度运动大鼠肝SMAD4和Hepcidin表达的影响[D];河北师范大学;2014年

2 王佳;IL-1β和TNF-α对原代培养的腹侧中脑神经元铁代谢的调控机制研究[D];青岛大学;2012年

3 陈兵兵;脑铁调素对膜铁转运蛋白1、二价金属离子转运蛋白1、铜蓝蛋白及其mRNA的调控[D];山西医科大学;2007年

4 付丽娟;Hepcidin在小鼠脑内的表达及其对铁转运相关蛋白的调控[D];河北师范大学;2005年

本文编号：2594903