3、7型腺病毒肺炎并发中枢神经系统疾病的机制研究

发布时间：2020-03-23 23:58

【摘要】：第一部分重庆地区3、7型腺病毒肺炎儿童并发中毒性脑病的临床特征分析目的:人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)是儿童呼吸道感染的常见病原,其中HAdV-3和HAdV-7是引起儿童重症肺炎的主要原因之一,中毒性脑病是HAdV-3和HAdV-7肺炎的重要并发症。大量临床资料显示HAdV-7感染病情严重程度明显重于HAdV-3,但两型肺炎并发中毒性脑病严重程度是否存在差异尚不清楚。本部分回顾性分析HAdV-3和HAdV-7肺炎住院患儿并发中毒性脑病的临床特点。方法:收集2009年6月至2014年12月因急性下呼吸道感染在重庆医科大学附属儿童医院呼吸病房住院且确诊为腺病毒感染患儿的鼻咽分泌物,提取DNA行PCR扩增后基因测序,Gen Bank比对分型,回顾性分析患儿临床资料,探讨两型腺病毒肺炎并发中毒性脑病是否存在差异。结果:1.HAdV阳性率及分型:2009年6月至2014年12月,共收集急性下呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物标本4678份,其中HAdV阳性307例(6.56%),成功测序分型280例。HAdV-7(129,45.09%)和HAdV-3(122,43.41%)是主要的血清型。2.HAdV-3和HAdV-7的临床特点:280例中HAdV-7与HAdV-3肺炎患儿相比,HAdV-7肺炎患儿更易出现高热、喘息,重症肺炎的发生率更高,易并发中毒性脑病和呼吸衰竭(p0.05)。3.重症HAdV肺炎并发中毒性脑病的临床特点:280例中29例(29/280,10.32%)重症肺炎并发中毒性脑病。HAdV-7(23/29,79.31%)是并发中毒性脑病的主要血清型(p0.05)。结论:HAdV是儿童急性下呼吸道感染的病原之一,其检出率为6.56%,HAdV-7和HAdV-3是检出的主要血清型。HAdV-7肺炎的患儿病情更重,更易发生中毒性脑病。第二部分3、7型腺病毒肺炎并发中枢神经系统疾病的实验研究目的:第一部分结果提示HAdV-7重症肺炎较HAdV-3易并发中毒性脑病,本部分拟建立腺病毒感染动物模型探讨两型腺病毒肺炎并发中枢神经系统疾病的实验研究。方法:1.体外,收集临床分离株HAdV-3、HAdV-7分别感染以及两者1:1混合感染A549细胞后0、2、8、12、24、36、48和72h标本,同时收集感染大鼠神经元细胞24h的上清标本,上清通过实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)检测其病毒拷贝数。2.体内,临床分离株HAdV-3 HAdV-7感染BALB/c建立腺病毒感染动物模型,收取感染后第3、5和7天的标本,脑组织、神经结通过免疫荧光检测病毒。血液和脑组织通过q-PCR检测病毒载量。结果:1.HAdV-7在感染A549细胞后病毒拷贝数明显高于HAdV-3(p0.05);HAdV-3在感染大鼠神经元原代细胞后病毒拷贝数明显高于HAdV-7(p0.05)。3.HAdV-3和HAdV-7感染BALB/c后3、5和7天,HAdV-7感染组在血液、神经结以及脑组织均未检测出病毒,脑组织中炎症介质(IL-1β、TNF-α和IL-6)、血清中炎症介质(TNF-α)水平明显升高(p0.05);HAdV-3感染组脑组织和神经结检测出病毒,血液内未检测出病毒,脑组织和血清炎症介质水平正常。结论:HAdV-7毒力强于HAdV-3,但HAdV-3可通过病毒侵入中枢神经系统致病毒性脑炎,而HAdV-7通过释放炎症介质致中毒性脑病。临床诊疗中7型腺病毒感染并发中毒性脑病应以阻断炎症反应为主,而3型腺病毒感染并发病毒性脑炎需拮抗病毒复制。第三部分HMGB1介导小鼠的7型腺病毒感染诱导的肺部炎症目的:第一部分和第二部分结果提示HAdV-3和HAdV-7是儿童重症肺炎的重要病原;由于HAdV-7感染释放大量炎症介质,HAdV-7肺炎的住院儿童的病情严重程度明显高于HAdV-3。因此,寻找治疗HAdV-7重症肺炎的靶点是控制腺病毒的关键。近年来发现高迁率族蛋白B1(HMGB1)作为内源性损伤相关分子模式(DAMP)的一员,通过坏死的呼吸道上皮细胞释放介导了大量炎症介质急性肺部炎症性疾病。尤其在较多病毒(如腺病毒、流感病毒等)感染导致的肺部炎症中扮演了重要角色,本研究探讨HMGB1在腺病毒肺炎中的作用,寻找HAdV-7肺炎的治疗靶点。方法:1.体外,收集HAdV-7感染A549细胞后0、2、6、8、12、24、36和48小时的上清和细胞爬片,通过免疫荧光和ELISA进行分析胞外HMGB1的表达以及水平。2.体内,收集正常和anti-HMGB1 m Ab BALB/c小鼠感染HAdV-7后第3天、5天和7天的肺组织和BALF标本,通过细胞分类计数、组织病理分析、ELISA和q-PCR等方法进行分析病毒拷贝数、HMGB1、TLR4、TLR9、RAGE和NF-κΒ、IL-1β、IL-6和TNF-α等水平。结果:1.体外,HAdV-7感染A549细胞后12小时,HMGB1由胞内转移到胞外逐渐增多,感染后24h、36h和48h较Control组显著升高(p0.05)。体内,感染后第3、5和7天小鼠肺组织(肺泡灌洗后)蛋白水平逐渐降低(p0.05)。2.体内,HMGB1在HAdV-7感染小鼠的第3天升高(p0.05),同时,TLR4受体和NF-κΒ在HAdV-7感染小鼠的第3天升高(p0.05)。3.体内,阻断HMGB1后,Anti-HMGB1 m Ab HAdV-7组肺组织病毒拷贝数在感染的3天明显较HAdV-7组降低,肺组织HE染色病理评分、细胞分类计数均在第3天明显较HAdV-7组降低(p0.05);TLR4受体、NF-κΒ基因水平在感染的第3天较HAdV-7组明显减低(p0.05)。结论:HAdV-7感染后HMGB1由胞内向胞外转移;在HAdV-7感染的第3天,HMGB1与TLR4受体结合激活NF-κΒ触发炎症介质的释放介导炎症反应和促进了病毒的复制。HMGB1可作为HAdV-7的治疗靶点。
【图文】：

病毒复制,拷贝数,病毒

图 2.1 HAdV-7 与 HAdV-3 病毒复制能力比较Figure 2. 1 Comparison of virus replication between HAdV-7 and HAdV-3A: HAdV-7 或 HAdV-3 感染 A549 细胞病变(CPE)，放大 100 倍，标尺 50um。B: HAdV-7 或HAdV-3 感染 A549 细胞后病毒拷贝数。C：HAdV-7 和 HAdV-3 共感染后病毒拷贝数（3 复孔，平均值±标准误）。*, **, ***p<0.05,0.01,0.001, 与 HAdV-3 比较A: Cytopathic effect (CPE) of A549 of cell after inoculated HAdV-7 or HAdV-3 (originalMagnification×100); the Scale for 100um (original Magnification×100). B: Relative virus copynumber of HAdV-7 or HAdV-3 in A549 cell. C: Competitive replication between HAdV-3,HAdV-7 in A549 cells (3 replicates each, mean±SEM). *, **, *** p<0.05, 0.01, 0.001, comparingwith HAdV-32.2 HAdV-3 在鼠神经元中病毒复制力高于 HAdV-7

免疫荧光,神经元,病毒,拷贝数

重庆医科大学博士研究生学位论文受体（红色），病毒仅见 HAdV-3 表达（绿色），未见 HAdV-7。为明确 HAdV-3、HAdV-7 在神经元细胞中是否存在病毒复制差异，本研究收集大鼠神经元原代细胞感染 HAdV-3 和 HAdV-7 后 24 小时标本提取 DNA（因 BALB/c 小鼠神经元感染HAdV 6 小时死亡，故换大鼠神经元原代细胞），q-PCR 检测病毒拷贝数，结果示HAdV-3 的病毒拷贝数明显高于 HAdV-7 见图 2.4。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.6;R747.9

【参考文献】