胶质瘤中PLK4表达及对胶质瘤增殖及耐药的研究

发布时间：2020-03-24 00:23

【摘要】：目的:利用胶质瘤样本数据库探讨PLK4在脑胶质瘤中的表达及与病理级别、预后以及化疗敏感性的相关性;借助RNA干扰结合表型实验在体内外证实PLK4对脑胶质瘤细胞增殖及对TMZ化疗敏感性的影响;进一步我们验证了课题组之前通过实验预测的PLK4与IκKε结合形成复合物从而激活IκKε/NF-κB/BCL2抗凋亡信号通路导致脑胶质瘤细胞增殖及对替莫唑胺化疗敏感性影响的机制,为对替莫唑胺化疗耐药的脑胶质瘤的治疗提供新的思路。方法:1.利用CGGA数据库中RNA-seq数据分析PLK4在WHO分级(II、III、IV)中m RNA表达水平;同时分析PLK4表达水平与患者完全生存周期的相关性,以及PLK4表达状态与化疗对患者生存期的影响。2.利用real-time PCR测定人胶质母细胞瘤细胞系U87MG,U251,LN229,U87EGFRv III中PLK4 m RNA表达水平;收集不同病理级别的人脑胶质瘤组织标本,real-time PCR测定每例组织标本中PLK4 m RNA的表达情况,蛋白免疫印迹测定人脑胶质瘤组织中PLK4蛋白表达情况;3.构建靶向PLK4的小分子干扰RNA,转染入U87MG,LN229细胞系,real-time PCR测定干扰序列敲低PLK4的敲低效率;用MTT实验和平板克隆形成实验测定敲低PLK4后细胞增殖能力;利用细胞免疫荧光实验验证敲低PLK4后对中心粒的影响;利用MTT试验测定细胞敲低PLK4后对TMZ化疗敏感性影响。4.利用U87MG细胞构建裸鼠颅内胶质瘤模型,设置对照组、敲低PLK4组,TMZ单纯治疗组,敲低PLK4联合TMZ治疗组,采取周期TMZ治疗,体内验证下调PLK4表达使肿瘤细胞对TMZ化疗敏感性增加。5.构建靶向NF-κB的荧光素酶报告基因质粒p NFκB-luc,利用荧光素酶报告基因实验验证NF-κB是PLK4下游的效应靶点。6.利用细胞免疫荧光实验检测PLK4与IκKε蛋白在细胞中定位情况;蛋白免疫印迹法测定下调PLK4后,IκBα蛋白表达水平;细胞免疫荧光实验验证下调PLK4后,NF-κB-p65蛋白定位变化;验证PLK4可以与IκKε结合形成复合物,导致IκBα降解并促进NF-κB-p65进入细胞核。7.设计BCL2抗凋亡基因PCR引物,利用real-time PCR测定细胞敲低PLK4 表达后,BCL2抗凋亡基因mRNA表达水平的变化,证明下调PLK4表达后抑制BCL2抗凋亡活性从而使肿瘤细胞对TMZ化疗敏感性增加。结果:1在CGGA胶质瘤样本m RNA表达谱中分析显示,PLK4 m RNA的表达与胶质瘤WHO病理分级存在明显正相关;PLK4高表达患者完全生存期明显缩短,且PLK4在高级别胶质瘤中的表达差异对患者完全生存期有明显影响;PLK4低表达状态的患者,化疗后患者生存期明显延长,PLK4高表达的患者,化疗后患者生存期无明显变化。证明PLK4在脑胶质瘤中的表达存在差异,且与病理分级、患者预后以及化疗敏感性明显相关。2.胶质瘤细胞系中PLK4 m RNA表达水平均较正常细胞增高,其中U87MG、LN229较高;人脑胶质瘤组织标本中PLK4 m RNA均有表达,高级别胶质瘤表达水平较低级别胶质瘤明显增高;但在PLK4蛋白表达水平与胶质瘤病理分级无明显相关。3.转染靶向PLK4小分子干扰RNA后的胶质瘤细胞系中,PLK4表达明显下调;细胞免疫荧光实验显示下调PLK4表达后中心粒数目减少;MTT实验及克隆形成实验均显示,下调PLK4表达后,胶质瘤细胞的增殖能力明显减弱;MTT实验显示,下调PLK4表达后,细胞对TMZ的化疗敏感性明显增加。4.U87MG颅内胶质瘤裸鼠动物模型显示,抑制PLK4联合TMZ治疗后,肿瘤生长速度明显减慢,动物完全生存期明显延长,HE染色显示联合治疗组的肿瘤边界较正常组明显缩小。免疫组织化学染色显示Ki-67表达水平明显减低。5.荧光素酶报告基因实验显示,胶质瘤细胞系中PLK4表达下调后,NF-κB荧光强度较正常细胞组下降,证明NF-κB是PLK4下游的效应靶点。6.细胞免疫荧光实验证实PLK4与IκKε存在蛋白共定位,证实PLK4可以与IκKε结合形成复合物;下调PLK4表达后,NF-κB p65亚基定位由细胞核转入细胞质。7.蛋白免疫印迹显示细胞下调PLK4后,IκBα表达水平上调,证明PLK4能够结合并磷酸化IκKε,使IκBα降解,从而导致下游信号通路的激活。8.胶质瘤细胞系中PLK4表达下调后,BCL2抗凋亡基因家族中BCL2-A1、BCL2-L1 m RNA表达水平下调,验证了PLK4激活了下游NF-κB/BCL2抗凋亡信号通路。结论:1.PLK4在脑胶质瘤中高表达,PLK4的表达与患者预后呈负相关,且在高级别胶质瘤中明显相关。2.PLK4低表达状态增加患者对化疗敏感性,延长患者生存期。3.PLK4在脑胶质瘤中高表达,其中PLK4 m RNA表达水平与病理级别呈正相关;蛋白表达水平与病理级别无明显相关。4.下调PLK4的表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖以及增强对TMZ化疗敏感性。5.PLK4能够结合IκKε,从而激活NF-κB信号通路,促进BCL2抗凋亡基因的表达,从而使胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性降低,与课题组之前预测的信号通路相一致。6.下调PLK4表达联合TMZ治疗可以对胶质瘤存在治疗效果。
【图文】：

GA 数据库分析 PLK4mRNA 表达与胶质瘤病理级别的关系。患者标本 WH121 例，Ⅲ级 50 例，Ⅳ级 127 例，共 298 例。步分析 PLK4 与患者生存期的关系后发现：PLK4mRNA 表达水存期呈负相关（如图 2），，且在高级别胶质瘤中明显相关（P<0.0图 3-A）；而在低级别胶质瘤中无明显相关（P>0.05，如图 3-B）。

GGA 数据库分析 PLK4mRNA 表达与胶质瘤病理级别的关系。患者标本 W121 例，Ⅲ级 50 例，Ⅳ级 127 例，共 298 例。一步分析 PLK4 与患者生存期的关系后发现：PLK4mRNA 表达水生存期呈负相关（如图 2），且在高级别胶质瘤中明显相关（P<0如图 3-A）；而在低级别胶质瘤中无明显相关（P>0.05，如图 3-B）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

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本文编号：2597503