受体相互作用蛋白2及其抑制剂与肺炎链球菌脑膜炎的相关性研究

发布时间：2020-03-24 14:54

【摘要】：研究背景中枢神经系统(central nervous system,CNS)细菌感染累及脑膜及脑实质,是一类严重并难治的疾病。细菌性脑膜炎是易发生在婴幼儿时期的中枢神经系统感染性疾病,其中肺炎链球菌是我国最常见的细菌性脑膜炎的致病菌之一,也是导致神经系统后遗症的主要病原菌。尽管近年来有效抗生素的及时合理应用以及预防接种的大范围推行使得细菌性脑膜炎病死率较前有所降低,但神经系统相关后遗症如精神运动发育迟滞、智力损害、听神经损伤等仍居高不下,严重影响着幸存患儿的身心健康,给个人家庭和社会带来了极大的负担。固有免疫是机体免疫系统直接抵御病原体入侵的最初阶段,通过机体自身的特异性模式识别受体识别病原体特有的保守结构,即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),在宿主防御病原体侵袭中起到重要作用。核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NLRs)家族为胞浆内模式识别受体,迄今发现包括3个亚家族:核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD),核苷酸结合寡聚化结构域受体热蛋白(NOD-like receptor family pyrin domain-containing,NALP),神经元细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein,NAIP)。其中,NOD蛋白能够识别细菌细胞壁的成分——细菌肽聚糖(peptidoglycan peptidoglycan,PGN),活化NF-κB,参与针对病原相关受体的固有免疫和炎性反应。做为最具代表性的NOD蛋白家族成员,NOD1识别大多数革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性细菌PGN上含有meso-二胺基庚二酸(meso-DAP)的胞壁酰肽,而NOD2识别在所有细菌PGN上所产生的胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)。当NOD2识别细菌细胞壁的MDP,NOD2发生构象改变,募集活化受体相互作用蛋白 2(receptor-interacting protein2,RIP2/RICK/CARDIAK),诱导 NF-κB转运至细胞核并转录促炎症基因,引发炎症反应,导致细胞因子、趋化因子以及抗微生物肽的产生。RIP2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,归类为RIP家族的成员之一。RIP2的N端含有一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,在信号转导途径中发挥关键作用,RIP2受到刺激后,176位丝氨酸及474位酪氨酸发生自磷酸化,促进RIP2表达。多个炎症免疫调节异常及相关疾病的实例证明它们源于NOD2/RIP2的过度活化。而且,RIP2的激酶活性是NOD2发挥功能所必备的一部分,多个研究证明调节RIP2的表达及176位丝氨酸的自磷酸化是NOD2诱导细胞因子免疫应答不可或缺的。虽然RIP2做为NOD衔接蛋白的作用及泛素化理论已经建立,但是RIP2作为激酶的生物学作用仍待研究。是否可以通过调节RIP2的激酶活性减轻炎症反应及炎症造成的损伤,成为新的治疗靶点。吉非替尼是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGF-R)的ATP竞争性激酶抑制剂,且作为含有EGF-R变异的非小细胞性肺癌患者的一线临床药物。在放射性体外激酶测定及组织培养实验中证明了吉非替尼使得RIP2自磷酸化失败,这表明吉非替尼在体外表现出抑制RIP2的作用,从而降低了 RIP2的表达以及NOD刺激后细胞因子的产生。但尚未有体内试验证明相同的作用。目的通过建立幼鼠感染性脑膜炎动物模型,探索形成细菌性脑膜炎的有效菌液浓度,模拟肺炎链球菌感染所致细菌性脑膜炎时,中枢神经系统受到炎症刺激后所形成的反应体系,主要目标在于探究中枢神经系统免疫作用细胞的功能并验证肺炎链球菌是NOD2/RIP2的有效刺激因子;通过对肺炎链球菌感染小鼠神经细胞的NOD2/RIP2与NF-κB下游信号通路的检测,分析RIP2作为NOD衔接蛋白的作用及泛素化理论;进一步探究RIP2抑制剂吉非替尼对细菌性脑膜炎细胞因子的影响,观察它对炎症后脑损伤的保护作用,更好的了解RIP2在肺炎链球菌性脑膜炎中的激酶活性并探究RIP2作为治疗靶向蛋白的可能证明吉非替尼作为RIP2的抑制剂在肺炎链球菌性脑膜炎所致细菌性炎症的治疗可能。方法1.出生6-8周C57BL/6野生雄性小鼠66只,体重22-28g,随机将动物分为对照组(6只)和试验组(60只),其中试验组根据细菌菌液的不同接种浓度划分为三个亚组,即低浓度组(0.5×107cfu/uL)、中浓度组(0.5×108cfu/uL)及高浓度组(0.5×109cfu/uL),每亚组20只动物。每日按规定时间观察接种后各组小鼠的临床表现并评分记录;于接种后0小时、24小时、48小时、72小时及120小时处死每组小鼠各4只,用于病理学观察及脑匀浆细菌培养测定。2.建立肺炎链球菌脑膜炎动物模型,观察小鼠的临床表现并取脑匀浆进行细菌培养,计数肺炎链球菌菌落;HE染色用以观察脑膜和脑组织形态学改变;用免疫组织化学技术观测P-RIP2在小鼠脑组织中的定位及表达;用免疫蛋白印迹技术(Western-blot)检测脑组织中NOD2、RIP2的表达变化规律。3.将64只C57BL/6野生雄性小鼠随机分为生理盐水组(NS)、肺炎链球菌脑膜炎组(SP)、抑制剂组(Gefitinib)和溶媒组(DMSO)。每组16只小鼠。采用侧脑室注射肺炎链球菌细菌悬液/生理盐水;腹腔注射吉非替尼/溶媒DMSO的方法建立模型。建模后置笼中饲养,观察临床表现。于建模后72小时处死动物,立即取脑组织备用。免疫组织化学技术观察P-RIP2在各组脑组织中的表达;用免疫蛋白印迹技术(Western-blot)检测脑组织中NOD2、RIP2、P-RIP2及NF-κB的表达变化;用实时反转录聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组小鼠脑组织中目的蛋白(NOD2/RIP2)的相对表达水平。4.将64只C57BL/6雄性小鼠随机分为生理盐水组(NS)、肺炎链球菌脑膜炎组(SP)、抑制剂组(Gefitinib)和溶媒组(DMSO)。每组16只小鼠。于建模后72小时处死动物,采用酶联免疫法(ELISA)检测脑组织中细胞因子IL-6、TNF-α的浓度变化;将小鼠脑组织行HE染色以观测脑膜和脑组织形态学改变;采取双盲法两人定时对小鼠进行临床症状评分。结果1.无论接种浓度高低,所有试验组小鼠在接种细菌悬液后,均出现了脑损伤的症状,其中高浓度组小鼠在接种细菌悬液120小时全部死亡。对照组小鼠麻醉苏醒后一般情况良好,精神进食均好,恢复较快,无脑损伤症状出现。所有试验组小鼠脑匀浆均培养出与接种同株的肺炎链球菌,细菌滴度与接种浓度无密切相关。对照组小鼠的脑匀浆无细菌生长。大体观察,试验组小鼠可见脑组织体积增大、血管充血、脑回明显增宽、脑沟变浅。而对照组小鼠的脑组织无上述变化。HE染色病理学观察,对照组未见明显炎性细胞浸润。试验组在接种细菌悬液24小时其脑室周围、海马区即出现少许炎性细胞浸润,接种细菌72小时可见蛛网膜下隙呈炎性改变,HE染色可见软脑膜血管扩张,蛛网膜下隙膨胀,内颗粒层神经元肿胀,呈气球样变性,海马及其脑室周围可见中性粒细胞浸润。2.生理盐水组大脑皮质NOD2/RIP2/P-RIP2蛋白表达较低,而肺炎链球菌脑膜炎组NOD2/RIP2/P-RIP2蛋白表达显著升高,于感染初期即建模后24小时内即有升高,且呈时效性变化,至72小时最为显著,120小时呈持续平稳升高趋势。皮层NF-κB蛋白水平于肺炎链球菌刺激诱导后72小时明显升高,与建模0小时相比较有显著性差异。P-RIP2免疫反应阳性细胞遍及肺炎链球菌脑膜炎小鼠的皮层神经元、胶质细胞。3.肺炎链球菌脑膜炎组及溶媒组小鼠大脑皮层及海马区可见广泛表达的P-RIP2免疫阳性细胞,明显高于生理盐水组;而吉非替尼组小鼠P-RIP2免疫阳性细胞明显低于肺炎链球菌脑膜炎组。Western-blot结果显示,小鼠脑组织中NOD2、RIP2、P-RIP2及NF-κB蛋白在肺炎链球菌脑膜炎组及溶媒组小鼠明显升高,与生理盐水组相较,差异显著(P0.01);而与肺炎链球菌脑膜炎组小鼠相比,吉非替尼明显降低了 P-RIP2的表达,差异有统计学意义(P0.05)。且吉非替尼组小鼠NF-κB蛋白表达明显降低,与肺炎链球菌组比较,有显著性差异(P0.05)。肺炎链球菌脑膜炎组小鼠皮层NOD2 mRNA的表达较生理盐水组明显上升,相比有显著差异(P0.05)。而吉非替尼组小鼠皮层NOD2 mRNA水平与肺炎链球菌脑膜炎组比较无显著差异(P0.05)。RIP2 mRNA在生理盐水组小鼠皮层的表达水平较肺炎链球菌脑膜炎组小鼠明显升高,相较有显著性差异(P0.05)。而肺炎链球菌脑膜炎组与吉非替尼组二者相较无显著性差异(P0.05)。4.ELISA法检测结果表明NOD2-RIP2信号通路激活后能促使细胞因子IL-6、TNF-α的分泌上升,且呈时效性增长,即炎症刺激后72小时内呈现递增的趋势。各组间比较,吉非替尼组小鼠IL-6、TNF-α含量显著低于肺炎链球菌脑膜炎组、溶媒组小鼠(P0.05),但仍高于生理盐水组(P0.05)。光镜观察:肺炎链球菌脑膜炎组、溶媒组小鼠脑组织可见软脑膜血管扩张,蛛网膜下隙膨胀,内颗粒层神经元肿胀,呈气球样变性,软脑膜及其脑室周围可见中性粒细胞浸润,出血坏死灶。吉非替尼组小鼠脑组织细胞肿胀、空泡变性较肺炎链球菌脑膜炎组、溶媒组少,脑皮质结构完整,海马区细胞排列基本整齐,血管间隙略增宽,可见少量炎症细胞浸润。生理盐水组细胞形态规整,大小一致,无炎症反应和神经元损伤存在。肺炎链球菌脑膜炎组、溶媒组小鼠出现精神萎靡、嗜睡,皮毛粗糙,呕吐,反应迟缓,运动失调、抽搐、角弓反张等脑损伤症状较吉非替尼组明显增加。生理盐水组小鼠麻醉苏醒后一般情况良好,精神进食均好,恢复较快,无上述症状出现。结论1.C57BL/6小鼠经侧脑室注射可以成功建立感染性脑膜炎动物模型,经检测小鼠神经病理学改变,可以更加贴切的反应人类婴幼儿脑膜炎的发生、发展过程,进而为研究脑损伤的发生机理提供可靠的实验依据。2.肺炎链球菌感染致使NOD2显著增加,提示NOD2参与细菌炎症免疫反应的启动。验证了肺炎链球菌是NOD2-RIP2信号通路的有效刺激因子,即胞内NOD2-RIP2-NF-κB/MAPKs信号通路在细菌及其代谢产物作用于细胞内的炎性反应中发挥着重要的功能。3.吉非替尼可以通过抑制RIP2磷酸化以减少体内RIP2的表达,提示通过抑制RIP2磷酸化或是吉非替尼发挥保护性作用的原因。4.在RIP2抑制作用下,巨噬细胞分泌的炎症细胞因子,即肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)明显减少,有效缓解肺炎链球菌所致的脑损伤。意义本研究表明,通过向小鼠侧脑室内注入肺炎链球菌菌液可以成功诱导出细菌性脑膜炎。当细菌性脑膜炎发生时,脑组织NOD2-RIP2表达显著上升,提示NOD2-RIP2-NF-κB/MAPKs信号通路参与细菌炎症免疫反应的启动,促进炎症的形成和发展。抑制剂吉非替尼能抑制RIP2的磷酸化,减轻脑水肿,保护神经元免受炎性损伤。上述结论启示RIP2或是调节炎症性疾病的一个可行的药理学靶点,在未来的细菌性脑膜炎治疗中,为防治细菌性脑膜炎及其它中枢神经系统感染性疾病提供了借鉴。
【图文】：

图１．邋１不同菌液浓度引起试验组小鼠的抽搐率（＊Ｋ0．邋０５）逡逑

图１．邋２菌液浓度对生存率的影响逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.9

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