大动脉粥样硬化型急性缺血性脑卒中生物学诊断标志物的实验研究

发布时间：2020-03-24 18:27

【摘要】：急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)是常见的神经系统疾病,具有高发病率和死亡率的特点。该病的诊断主要以临床表现结合影像学检查为主。但发病时间不确定、症状不典型、影像学检查延迟或阴性的患者的诊断仍较为困难。寻找急性缺血性脑卒中超早期的生物学标志物,有助于缩短血管再通时间,改善患者预后。动脉粥样硬化被认为是急性缺血性脑卒中的主要病因之一,并且大动脉粥样硬化型(Large-artery atherosclerosis,LAA)急性缺血性脑卒中的死亡率和复发率较高。有研究表明,血浆中的miRNA可以作为众多疾病的生物学标志物。但目前国内外关于大动脉粥样硬化型AIS超早期特异表达的miRNA的研究较少,而且miRNA在脑卒中进展过程参与调控的分子机制尚不完全清楚。目的:本研究通过高通量miRNA芯片筛选大动脉粥样硬化型AIS超急性期特异表达的miRNA,并对特异表达的miRNA进行靶基因预测和生物信息学分析,探讨这些差异表达的miRNA在大动脉粥样硬化型AIS中可能参与的生物学过程。为大动脉粥样硬化型AIS的诊断和治疗奠定实验和理论基础。方法:1.选取中国人民解放军联勤保障部队第九八一医院就诊的“急性脑卒中Org10172治疗试验(TOAST)”病因分型为大动脉粥样硬化型AIS患者12例,动脉粥样硬化患者13例,以及同期健康体检者15例作为对照组,通过高通量miRNA芯片技术,检测所有入试者血浆中miRNA的表达谱,筛选出在大动脉粥样硬化型AIS中特异表达的miRNA。2.通过TargetScan、miRwalk和miRDB三个靶基因预测数据库预测特异表达的miRNA的靶基因。3.通过STRING数据库获取特异表达miRNA的靶基因间的相互作用关系,用Cytoscape软件构建靶基因间的蛋白相互作用网络。4.使用DAVID在线数据库,对特异表达miRNA的靶基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。5.培养Wistar大鼠的皮层神经元细胞,设立miR-129-1-3p mimics转染组、miR-129-1-3p inhibitor转染组及阴性对照组序列转染组,验证miR-129-1-3p对神经元轴突生长和靶基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)蛋白表达水平的影响。6.采用ROC(Receiver operating characteristic curve)曲线分析miRNA对大动脉粥样硬化型AIS的诊断价值。结果:1.与健康对照组相比,大动脉粥样硬化型AIS组有27个miRNA出现差异表达,其中20个miRNA上调,7个miRNA下调。与动脉粥样硬化组相比,大动脉粥样硬化型AIS组有9个miRNA出现差异表达,包括5个上调的miRNA和4个下调的miRNA。2.miR-129-1-3p,miR-4312,miR-5196-3p在大动脉粥样硬化AIS中特异性表达。miR-129-1-3p和miR-4312的表达在动脉粥样硬化组和大动脉粥样硬化AIS组中逐渐增加。3.靶基因预测结果表明,miR-129-1-3p靶向172个常见基因,其中Runx2被预测为miR-129-1-3p的靶基因。4.蛋白互作网络显示,miR-129-1-3p的靶基因之间存在广泛联系,Runx2与多种靶基因存在相互作用关系,提示Runx2可能在多种生物学过程的分子调控网络中起到关键作用。5.DAVID分析结果显示,miR-129-1-3p的靶基因被富集到多种与轴突和突触相关的生物学过程、细胞组分、分子功能和信号通路中。提示miR-129-1-3p可能参与调节神经元轴突和突触的功能。6.转染实验结果显示,在Wistar大鼠的皮质神经元细胞中过表达miR-129-1-3p后,神经元轴突延伸受到明显抑制,同时Runx2的蛋白表达水平降低;而抑制miR-129-1-3p的表达时,轴突延伸长度明显增加,Runx2的蛋白表达水平升高。7.ROC曲线显示,miR-129-1-3p和miR-4312在大动脉粥样硬化型AIS中具有良好的敏感性和特异性。结论:1.miR-129-1-3p和miR-4312可能是诊断大动脉粥样硬化型急性缺血性卒中的生物学标志物,具有良好的敏感性和特异性。2.miR-129-1-3p可能通过靶向Runx2影响皮质神经元轴突生长。3.通过抑制miR-129-1-3p过表达促进皮质神经元的轴突生长,可能为大动脉粥样硬化型急性缺血性脑卒中的治疗提供新思路。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3

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本文编号：2598682