nNOS不同位点的磷酸化在神经病理性疼痛中的作用机制

发布时间：2020-03-25 19:33

【摘要】：目的:神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是一种临床常见的疼痛疾病,其病因繁多,机制复杂。NP可由多种疾病引发,不同于组织损伤所致的急性疼痛,其程度重、病程长,目前治疗手段仍难以达到理想效果,因此关于其发病机制的研究一直是疼痛研究者的重要任务。疼痛发生过程中,神经型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKⅡ)CaMKⅡ、突触后致密蛋白95(Post Synaptic Density protein PSD-95)等都参与了疼痛发生的过程。本研究以nNOS为切入点,目的在于探究在神经病理性疼痛发生的过程中nNOS在哪些位点发生了磷酸化,其磷酸化在神经病理性疼痛的发病机制起到了何种作用。同时也研究了CaMKⅡ及PSD-95与是否参与了nNOS磷酸化的过程。研究方法:所有实验动物(雄性SD大鼠共110只)随机分为13组,分别为非手术组(Naive)(n=5)、假手术组(Sham)(n=20)、SNI手术后1天组(D1)(n=10)、SNI手术后3天组(D4)(n=10)、SNI手术后7天组(D7)(n=10)、SNI手术后10天组(D10)(n=20)、SNI手术后14天组(D14)(n=10)、DMSO+SNI手术组(DMSO)(鞘内给药:10ul/rat,n=10)、KN93+SNI手术组(KN93)(30uM/10ul/rat,n=10)、Wortmannin+SNI手术组(Wortmannin)(40uM/10ul/rat,n=5)。所有实验动物手术前后均需测量下肢缩爪阈值(paw withdrawal threshold,PWT)。需要手术的实验鼠预先制作鞘内置管模型,大鼠恢复7天之后制作坐骨神经分支损伤(Spared nerve injury,SNI)模型。术后每日均采集PWT,于术后第1天开始进行鞘内给药,连续给药至术后第10天。在各个对应时间点检测脊髓中CaMKⅡThr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表达量、PSD-95表达量。并通过2`-5`-ADP-agarose提纯脊髓中的nNOS并检测其中nNOS Ser1417磷酸化水平(nNOS-NP1417),nNOS Ser847磷酸化水平(nNOS-NP847),以及在nNOS沉淀样品中CaMKⅡ Thr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表达量、PSD-95表达量。结果:第一部分:通过检验nNOS不同位点磷酸化是否表达,并通过KN-93及Wortmannin等抑制剂验证在NP过程中nNOS是否发生磷酸化以及不同位点磷酸化量与时间变化之间的关系。经过试验得出以下结果:SNI可令大鼠机械痛阈值降低(P0.05),nNOS Ser847以及Ser1417在疼痛过程中都发生磷酸化。但表达量最高时间点不同,在鞘内分别给予KN-93及Wortmannin后,与之相应的nNOS Ser847和Ser1417磷酸化明显减少(P0.05)。第二部分:通过检测脊髓中CaMKⅡ磷酸化的表达量并结合动物形态学变化证明疼痛的发生是否与CaMKⅡ的活性有关。并通过Agaros共沉淀nNOS,检测nNOS沉淀样品中是否有CaMKⅡ以及PSD-95的表达,判断在NP发生过程中这几种相关蛋白是否结合在一起。经过试验得出以下结果:在NP发生过程中,CaMKⅡ会发生Th 286自磷酸化从而被激活参与疼痛发生过程,表达量明显增高(P0.05),其变化趋势与疼痛行为学趋势一致。在给予CaMKⅡ活性抑制剂KN-93后PWT明显升高(P0.05)。而在nNOS沉淀样品中检测到了CaMKⅡ、CaMKⅡ自磷酸化、以及PSD-95的表达。并且通过计算结果发现CaMKⅡ自磷酸化的表达与PWT趋势类似。而PSD-95和CaMKⅡ的表达趋势也与疼痛行为学趋势近似。而当鞘内注射KN-93后,nNOS沉淀样品中CaMKⅡ,PSD-95的表达量明显降低(P0.05).结果表明在NP产生的过程中CaMKⅡ与PSD-95及nNOS存在结合状态并一起参与整个过程。并且与CaMKⅡ活性相关。结论:1、在大鼠神经病理性疼痛模型中,nNOS Ser847及Ser1417分别被CaMKⅡ、PKB/Akt磷酸化,使nNOS活性分别下调和上调,导致NO合成量改变,对神经病理性疼痛起到了不同的调节作用2、在神经病理性疼痛产生过程中,CaMKⅡ,PSD-95及nNOS存在结合状态,并且参与疼痛过程,这种结合状态是CaMKⅡ磷酸化使nNOS Ser847磷酸化的关键。3、CaM-KⅡ与PSD-95可能通过调节nNOS磷酸化,从而在神经病理性疼痛发病机制中发挥作用。
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文3.结果3.1 疼痛缩足阈值检测结果各组SD大鼠缩足阈值的基础值没有统计学差异，制作SNI模型后，模型组的缩足阈值相比对照组和假手术组显著降低，在1天时与术前相比已经有明显统计学差异（P<0.001），10天组的缩足阈值最低，而从14天开始，缩足阈值有逐渐增加的趋势。模型组术后各时间点之间相比，无统计学差异。见图1（***P<0.001）。

对各个样本中所含nNOS Ser847磷酸化程度的检测发现，在术后10天时，磷酸化的程度最高，与术前相比有统计学显著差异（P<0.001），在10天后，，Ser847的磷酸化水平有逐渐减少的趋势。见图2.2A（*P<0.001）3.2.2 神经病理性疼痛大鼠脊髓 nNOS Ser1417 的磷酸化表达情况对各个样本中所含的nNOS Ser1417的磷酸化进行测定，发现在疼痛发生后，磷酸化量迅速上升。术后第一天磷酸化程度最强，与术前相比差异具有统计学意义（P<0.05），术后各时间点的组间统计没有明显差异（P>0.05）。见图2.2 B（*P<0.05）
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741

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本文编号：2600335