【摘要】：胶质瘤(glioma)属于高度恶性脑肿瘤,其高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率等特点使其成为困扰临床医生的难题。目前,胶质瘤的发病机制尚不清楚,临床上仍缺乏安全有效的治疗方法。近年来有研究发现大脑可以通过脑膜淋巴管与外周免疫系统连接。这一发现让学术界重新认识大脑免疫微环境与神经系统疾病的关系。肿瘤免疫治疗也为临床工作人员提供了胶质瘤治疗新手段。目前免疫治疗包括免疫检查点治疗、过继免疫治疗、肿瘤疫苗治疗等。其在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和血液系统恶性肿瘤中抗癌效应良好。但免疫治疗在胶质瘤中尚处于初步阶段。肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的影响下行使其功能。TME是一个由肿瘤细胞、细胞外基质、免疫细胞等共同构成的肿瘤局部的病理环境。胶质瘤其独特的TME能影响胶质瘤侵袭性,相关研究成为近年来的热点,逐渐受到研究者们的重视。胶质瘤TME中除了肿瘤细胞还包括非肿瘤细胞,例如肿瘤相关成纤维细胞、血管内皮细胞以及瘤体中的免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等)。其中肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)作为一类重要的炎症细胞可通过分泌释放多种细胞因子和趋化因子,调节肿瘤侵袭能力,在肿瘤细胞的增殖、浸润和肿瘤血管的生成中发挥重要的作用。有文献报道TAMs与恶性肿瘤血管生成、转移及患者预后有密切关系,可作为恶性肿瘤患者预后的一种独立评价指标。胶质瘤TME中的TAMs(主要包括原位定植于脑部的小胶质细胞及血脑屏障破坏后浸润的骨髓来源的巨噬细胞)作为一线的免疫细胞具有极大的可塑性,既可在胶质TME中受胶质瘤分泌细胞因子的调控而促进肿瘤的生长及侵袭,也可以在特定环境下成为杀伤肿瘤的一员。而在以往对巨噬细胞在先天性免疫疾病及炎症反应中研究较多,但是其在肿瘤中所扮演的角色尚需探索。从芍药干燥根中提取的白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)其主要成分(40%)是芍药苷(paeoniflorin,Pae)。为提高芍药苷的生物利用度,我所对其结构改造,合成了芍药苷-6-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)。课题组前期研究发现CP-25可抑制肝癌细胞的增殖并且CP-25对巨噬细胞表现出了免疫调控的作用,这提示CP-25有可能通过免疫调控TME中TAMs从而影响肿瘤的发生发展。我们组的前期研究结果也证实CP-25的确能通过影响了TAMs间接降低了胶质瘤细胞的增殖及迁移能力。所以我们推测CP-25的抑癌机制可能与调节胶质瘤TME中的TAMs有关。但具体通过何种机制发挥这种调节作用,目前仍不明确。因此CP-25如何通过调节TAMs影响胶质瘤微环境从而发挥抑制胶质瘤细胞生长的作用,是本文的研究重点。目的:揭示CP-25能否通过调控免疫调控TAMs从而抑制胶质瘤的发展,并进一步阐明CP-25调节胶质瘤TAMs中影响胶质瘤的生长微环境的具体分子机制,为胶质瘤的治疗及发病机制研究提供实验依据。方法:共收集45例人的胶质瘤及癌旁组织标本,检测胶质瘤组织中巨噬细胞的浸润、新生血管生成及炎症发生情况。从病人胶质瘤组织中分离原代TAMs和原代肿瘤细胞,结合人源胶质瘤细胞系T98G和小鼠胶质瘤细胞系GL261,在体外建立原代TAMs和三种胶质瘤细胞共培养体系。利用CCK-8和Transwell实验研究CP-25能否通过作用于原代TAMs间接抑制三种肿瘤细胞的增殖和迁移。体内实验部分共构建三种肿瘤模型:a.GL261细胞注射裸鼠背部皮下构建异位植瘤模型;b.人源原代肿瘤细胞注射到裸鼠脑部构建原位PDX模型;c.将CX3CR1-GFP小鼠骨髓细胞移植到辐射后WT小鼠中建立骨髓嵌合体模型,再将GL261细胞注射到裸鼠脑部构建脑部原位肿瘤模型。利用这三个肿瘤模型在体内研究CP-25通过影响TAMs从而影响胶质瘤生长的抑制作用。计算小鼠肿瘤模型的生存周期;对肿瘤模型中形成的瘤体HE染色;qPCR、western blot免疫组化法检测瘤体中血管生成相关因子CD31、VEGF、α-SMA,炎症相关因子TNF-α、IL-1、IL-6和骨髓来源的巨噬细胞标志物Ly6C、CD11b的表达。对于骨髓嵌合体小鼠的肿瘤模型,利用流式细胞术研究CP-25对瘤体中原位的TAMs和骨髓来源的TAMs的作用。为了研究CP-25是否影响TAMs介导的血管生成,我们利用CP-25处理后的TAMs培养基培养HUVEC细胞,利用CCK-8、Transwell和Tube formation实验研究CP-25通过作用于TAMs抑制了HUVEC的增殖、迁移和成管能力。Western blot检测AKT通路关键蛋白(PI3K、AKT、p-AKT、TSC2、mTOR)在临床胶质瘤组织中和原代TAMs中的表达。利用qPCR、流式细胞术和ELISA检测CP-25和AKT通路抑制剂LY294002体外作用于原代的TAMs,对其AKT通路关键蛋白(PI3K、AKT、p-AKT),血管生成相关因子(VEGF、MMP2、MMP9)的作用。LY294002处理后TAMs的培养基继续培养原代肿瘤细胞和HUVEC,利用CCK-8,Transwell和Tube formation检测AKT通路抑制TAMs对原代肿瘤细胞的增殖和迁移及HUVEC增殖、迁移和成管的影响。结果:1.胶质瘤患者的肿瘤组织血管生成及TAMs浸润情况。我们收集了45例胶质瘤患者胶质瘤及癌旁组织。PCNA染色显示肿瘤组织中恶性增殖的细胞明显高于癌旁组织;HE染色结果显示胶质瘤的平均血管计数明显高于相邻的癌旁组织,并且血管生成标志物CD31、VEGF和α-SMA的表达高于癌旁组织;人脑胶质瘤组织中TAMs浸润明显高于癌旁组织;一系列炎症和血管生成相关基因的表达在胶质瘤组织中的表达也显著高于癌旁组织。2.CP-25通过调节原代TAMs对胶质瘤细胞功能的影响。从胶质瘤组织中分离原代TAMs和原代肿瘤细胞,结合人源胶质瘤细胞系T98G和小鼠胶质瘤细胞系GL261,在体外建立原代TAMs和三种胶质瘤细胞共培养体系。CCK-8和Transwell实验证实CP-25(10~(-4)~10~(-6)M作用6天)能通过作用于原代TAMs间接抑制三种肿瘤细胞的增殖和迁移能力。3.CP-25在小鼠异位胶质瘤模型和PDX胶质瘤模型中的作用。GL261细胞注射裸鼠背部皮下构建异位植瘤模型,CP-25(50mg/kg灌胃3周)能显著抑制GL261细胞在体内形成瘤体的生长速度和瘤体内的新生血管生成。CP-25能明显降低新生瘤体中血管生成标志物CD31、VEGF、FLT1、MMP2、MMP9、HIF1A、α-SMA和炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达。人源原代肿瘤细胞注射到裸鼠脑部构建原位PDX模型,CP-25(50mg/kg灌胃4~5周)能显著提高荷瘤小鼠的生存周期。CP-25也能明显降低新生瘤体中血管生成标志物CD31、VEGF、α-SMA和炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达。此外CP-25还能诱导新生瘤体中缺氧相关因子的表达。4.CP-25对TAMs介导的血管生成的影响。CP-25(50mg/kg灌胃4~5周)能显著抑制新生瘤体中TAMs的浸润。并且CP-25能抑制原代TAMs中血管生成相关因子MMP2、MMP9、VEGFA的表达,促进TAMs的吞噬能力。利用CP-25(10~(-5)M作用6天)处理后的TAMs培养基培养HUVEC细胞,利用CCK-8、Transwell和Tube formation实验证实CP-25通过作用于TAMs抑制了HUVEC的增殖、迁移和成管能力。5.CP-25对骨髓来源TAMs在胶质瘤中浸润的影响。先将CX3CR1-GFP小鼠的骨髓细胞移植到辐射后的WT小鼠中制备嵌合体模型,后向嵌合体小鼠脑部注射GL261细胞建立胶质瘤模型。流式细胞术结果显示嵌合体小鼠骨髓来源的TAMs细胞(CD45~(hi)CD11b~(hi))几乎全部来自CX3CR1-GFP小鼠的骨髓细胞。经CP-25(50mg/kg灌胃3~4周)处理后,骨髓来源TAMs的在肿瘤中的浸润明显受到抑制。而肿瘤原位定植的小胶质细胞(CD45~(int)CD11b~(hi)),经CP-25处理后大部分保留在肿瘤内,显示CP-25特异性抑制了骨髓来源TAMs向肿瘤组织的浸润。此外,嵌合体模型的肿瘤组织免疫组化PCNA染色和流式细胞术检测Ki-67结果显示,CP-25能抑制骨髓嵌合体小鼠脑部的肿瘤生长。6.CP-25对TAMs中PI3K-AKT信号通路的作用与癌旁组织相比,Western blot及IHC结果显示胶质瘤中PI3K-AKT信号通路通路活性上调。流式细胞术结果显示,在分离的TAMs中,PI3K-AKT通路关键蛋白表达也明显增加。流式细胞术结果提示CP-25(10~(-5)M作用24~48h)和LY294002(10μM作用24~48h)均可抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路中关键蛋白的表达水平。RT-qPCR显示抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路可下调血管新生标志物mRNA水平,ELISA结果显示抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路可下调VEGF分泌。CCK-8增殖实验及Transwell迁移实验结果显示LY294002处理后TAMs条件培养基可抑制胶质瘤细胞的体外增殖和迁移;及抑制HUVEC增殖、迁移和成管。结论:1.和癌旁正常组织相比,临床胶质瘤患者的胶质瘤组织中新生血管生成及TAMs浸润明显增多。2.CP-25在体外水平通过调节原代TAMs间接抑制胶质瘤细胞的增殖与迁移能力。3.CP-25在体内水平显著小鼠异位肿瘤模型和脑部原位PDX模型的肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存周期。并且CP-25能明显下调瘤体中新生血管生成和TAMs的浸润。4.CP-25能抑制TAMs介导的HUVEC的增殖,迁移和成管能力。5.利用骨髓嵌合体小鼠肿瘤模型证实CP-25特异性抑制骨髓来源TAMs在胶质瘤中的浸润。6.CP-25通过抑制TAMs中PI3K-AKT信号通路改善胶质瘤细胞的肿瘤微环境。
【图文】：
1. CP-25 合成示意图 CP-25 是我所对白芍总苷(TGP) 中主要有效活性单体成分芍药苷Pae) 结构进行酯化修饰而合成的新型具有抗炎免疫作用的活性单体药物。ig 1. Synthesis diagram of CP-25 CP-25 is a new type of active monomer drug withnti-inflammatory and immune effects synthesized by esterification of Pae, the main activeonomer in TGP.
5 合成示意图 CP-25 是我所对白芍总苷(TGP) 中主要有效活性单体成进行酯化修饰而合成的新型具有抗炎免疫作用的活性单体药物。thesis diagram of CP-25 CP-25 is a new type of active monomer matory and immune effects synthesized by esterification of Pae, the m TGP.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
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本文编号：2601779
