【摘要】：[研究背景]帕金森病(Parkinson's disease,PD)作为第二大神经退行性疾病,发病率逐年递增,PD的主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丧失,以及在损伤神经元出现以α-突触核蛋白(α-synuclein)为主要成分的路易小体(Lewy body)的聚集。PD的发病机制至今尚不明确,许多研究证明PD是一种多因素共同作用所导致的综合性疾病。泛素-蛋白酶体系统紊乱与线粒体功能障碍在PD的病程进展中发挥着十分重要的作用。E3泛素连接酶TRIM31(Tripartite motif-containing protein 31)在细胞内主要定位于线粒体,属于具有泛素连接酶活性的TRIM家族,可对特定的靶分子进行泛素化修饰和降解,参与细胞增殖、分化、发育、抗病毒、癌变和凋亡等多种细胞生物学过程。已有研究表明TRIM31与癌症和炎性疾病有关,然而TRIM31是否参与到PD的病理进程目前还没有报道。最近研究发现,在抗病毒天然免疫中,TRIM31可以通过其E3泛素连接酶活性对MAVS进行K63位泛素化修饰使其活化,从而促进IFN-β的产生。而IFN-β被证实在多巴胺能神经元的正常功能和存活中发挥着十分重要的作用,IFN-β缺失的小鼠会自发的出现运动失调和学习认知障碍。因此,本论文将探讨TRIM31对PD的作用及其初步机制。[研究目的]本课题利用6-OHDA、MPTP化学刺激诱导PD模型,探讨TRIM31在PD中的作用及机制。[研究方法]1.探究TRIM31缺失对小鼠的影响1.1通过水迷宫和Rota-rod行为学检测不同年龄段TRIM31基因敲除(TRIM31-/-)小鼠运动协调能力及学习记忆能力的改变。1.2电镜观察2、4、6个月TRIM31-/-小鼠黑质线粒体形态学变化。2.确定TRIM31在PD模型后的表达及其细胞定位。2.1使用6-OHDA、MPTP建立小鼠PD模型,于造模后不同时间取小鼠黑质及纹状体组织,利用Western blot、Immunohistochemical检测模型成功情况,Western blot检测TRIM31蛋白水平。2.2免疫荧光法检测TRIM31在黑质中与小胶质细胞,星形胶质细胞和神经元的共定位情况。2.3体外培养人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞,使用MPP+、6-OHDA刺激建立体外PD模型,于给药后24h收取细胞,检测TRIM31在细胞中蛋白水平的改变。2.4通过免疫荧光染色法,检测TRIM31在线粒体的分布。3.确定TRIM31在PD模型中的作用3.1使用MPTP、6-OHDA分别在野生型以及TRIM31-/-小鼠中建立PD模型,检测两种基因型小鼠行为学评分以及模型后生存率情况。3.2 Western blot和Immunohistochemical检测模型后两种基因型小鼠TH蛋白水平及TH阳性细胞数目变化。4.探讨TRIM31对MPTP、6-OHDA诱导的PD模型的调控作用及机制。4.1 Real-time PCR检测IFN-β、IL-1β的mRNA水平。4.2 Real-time PCR检测线粒体DNA缺失率。4.3Western blot检测线粒体稳态相关蛋白,过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α(PGC1α)、线粒体融合蛋白2(MFN2)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)蛋白水平变化。[研究结果]1.对TRIM31-/-小鼠进行行为学评价发现,4月龄的TRIM31-/-小鼠较野生型小鼠运动协调能力明显减退,在6月龄记忆能力开始出现显著性差异。并且电镜观察到4、6月龄TRIM3N31-/-小鼠黑质部位线粒体形态学的损伤,表现出线粒体肿胀、空泡化和线粒体嵴的断裂和消失。2.TRIM31在小鼠脑内尤其是黑质纹状体中有较高表达。在MPTP和6-OHDA诱导的小鼠PD模型中TRIM31蛋白表达明显升高。3.免疫荧光染色显示TRIM31的表达升高主要发生在黑质的神经元细胞中;在6-OHDA诱导的PD模型,小胶质细胞中TRIM31也有明显上调;星形胶质细胞中较少出现。4.在体外培养的SH-SY5Y中,MPP+、6-OHDA刺激后同样观察到了TRIM31的上调,激光共聚焦显示TRIM31主要定位于线粒体,并且MPP+、6-OHDA刺激可以促进TRIM31向线粒体转位。5.TRIM31基因缺失明显加重了MPTP和6-OHDA诱导的PD模型中小鼠的黑质纹状体DA能神经元损伤和运动能力障碍,TH蛋白水平以及THp阳性神经元的数目显著下降,TRIM31-/-小鼠与野生型小鼠相比在MPTP模型中存活率降低25%,在6-OHDA中存活率降低27%。6.在MPTP和6-OHDA诱导的小鼠PD模型中,野生型小鼠中黑质IFN-β的mRNA水平明显升高,TRIM31-/-小鼠中IFN-β的升高明显被抑制。在体外培养的SH-SY5Y中,虽然MPP+刺激没能引起IFN-β的升高,TRIM31的敲除显著降低了IFN-β的mRNA水平。7.在MPTP和6-OHDA诱导的小鼠PD模型中,TRIM31基因的缺失明显加重了MPTP和6-OHDA所致的PGC1α和OPA1蛋白水平的降低,但MFN2蛋白水平在两种基因型小鼠模型前后并无明显变化。TRIM31-/-小鼠在正常状态下即出现线粒体DNA缺失率增加的现象,在模型后TRIM31-/-小鼠与野生型小鼠相比,缺失率并未出现差异。[研究结论]在6-OHDA和MPTP诱导的PD模型中,TRIM31可以通过调节线粒体稳态及IFN-β水平保护DA能神经元,在PD中发挥着保护作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5
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