转录因子Bach1通过抑制Cyclin D1和MMP2调控胶质母细胞瘤生长的机制研究

发布时间：2020-03-31 10:02

【摘要】：多形性胶质母细胞瘤(GBM)为世界卫生组织划分的IV胶质瘤,是最常见和最具侵袭性的脑肿瘤。根据肿瘤的发病史,GBM可以分为两类:90%以上的GBM是原发性肿瘤,其余不到10%的是从低级(I-III级)胶质瘤发展来的(继发性肿瘤)。GBM的发病率随年龄增加而升高,在50-60之间达到一个高峰。目前用于新确诊的GBM病人的治疗方案是Roger提出的放疗一月后辅以6个月的150 200mg/m~2剂量的替莫唑胺治疗,相对于以往的放疗期间辅以低剂量替莫唑胺的治疗方案,GBM病人的平均生存期提高了3个月并且存活24个月的病人数提高了10%。尽管如此,GBM患者的生存仍然很短,因此寻找新的治疗靶点尤为迫切。Bach1(BTB和CNC的同源异聚体1)属于亮氨酸拉链因子家族的一员,含有两个具有转录调控作用的结构域:CNC-bZIP和BTB/POZ。不同于其他的碱性亮氨酸拉链因子,Bach1是一个相对特殊的转录因子。Bach1可以与含有Maf结构域的蛋白形成二聚体并结合在基因组上的Maf识别区域抑制靶基因转录。自从Bach1被发现以后,体外实验已经证明了其在癌细胞转移中发挥了重要作用。研究证明Bach1通过上调转移性基因CXCR4和MMP1,参与乳腺癌的骨转移。关于Bach1作为迁移和侵袭作用因子仍需要进一步的研究证实。关于参与癌症转移进程相关基因及信号通路的研究对提供有效的治疗方案是至关重要的,寻找Bach1在癌症转移调控中更多的靶基因是必要的。关于Bach1在不同癌症中作用还存在很大争议,且其在胶质母细胞瘤中的作用机制尚不清楚。因此,进一步研究Bach1在不同癌症中的作用及具体机制,分析其表达与癌症病人预后的关系,才能对Bach1成为癌症治疗的潜在靶点提供更好的理论依据。本研究目前取得的研究结果如下:1、Bach1在胶质母细胞瘤中的表达降低并与患者的预后密切相关为了更好的研究Bach1在胶质母细胞瘤中的作用,我们通过对胶质瘤病人的组织芯片进行IHC染色分析了Bach1的表达与胶质瘤分级的关系。我们发现相对于正常组织,Bach1在胶质瘤中的表达降低,并且随着胶质瘤级别的升高,Bach1的表达逐渐降低,其在胶质母细胞瘤中的表达最低。随后,我们利用免疫印迹技术检测了Bach1在几种胶质母细胞瘤细胞系和正常胶质细胞中的表达情况。同样地,相对于正常胶质细胞,Bach1在胶质母细胞瘤细胞系中的表达也是降低的。为了研究Bach1的表达与胶质母细胞瘤患者预后之间的关系,我们分析了TCGA数据库中Bach1的表达对患者生存的影响。结果显示,Bach1的低表达与胶质母细胞瘤患者生存率的减少密切相关。这一结果说明Bach1在胶质母细胞瘤中扮演一个抑癌基因的角色。因此,Bach1有成为胶质母细胞瘤临床诊断和预后分析指标的潜在可能。2、Bach1抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、转移和肿瘤生长为阐释Bach1在胶质母细胞瘤中的作用,我们构建了一组Bach1稳定过表达或沉默的胶质母细胞瘤细胞系。MTT实验结果显示,过表达Bach1抑制细胞增殖能力,而敲低Bach1可以促进细胞增殖。此外,BrdU掺入实验结果显示,Bach1过表达的细胞中DNA的合成相对于对照组细胞降低了30%左右。以上结果表明Bach1可以抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖,同样的结果在软琼脂克隆实验中得到了证实。为进一步研究Bach1对胶质母细胞瘤细胞的生物学影响,我们利用流式细胞仪检测了U87和U251细胞的细胞周期,发现过表达Bach1将胶质母细胞瘤的细胞周期阻滞在G1期。随后,我们利用Transwell实验研究了Bach1对细胞转移的影响。过表达Bach1可以显著抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移及侵袭,相反沉默Bach1可以促进细胞转移。为了研究Bach1在胶质母细胞瘤细胞成瘤中的作用,我们通过皮下注射将Bach1过表达的U87细胞和对照组细胞接种到裸鼠体内,发现过表达Bach1显著抑制肿瘤生长。此外,将上述细胞原位接种到裸鼠颅内,发现过表达Bach1可以抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期。以上结果说明,Bach1在胶质母细胞瘤中扮演一个抑癌基因的角色,抑制胶质母细胞瘤的发生进程。3、Bach1直接抑制Cyclin D1和MMP2的转录为探究Bach1抑制胶质母细胞瘤发生进程的分子机制,我们检测一些细胞周期及细胞转移调控相关的关键基因的表达。我们筛选到Cyclin D1和MMP2是Bach1的下游基因。为证实Bach1是否直接调控Cyclin D1和MMP2的转录,我们构建了一系列包含不同的Cyclin D1和MMP2启动子区域的报告载体,利用双荧光素酶报告实验,证明Bach1可以结合到Cyclin D1和MMP2的启动子上并抑制它们的基因转录。为了进一步寻找与Bach1直接结合的Cyclin D1和MMP2启动子区域,我们对U87细胞进行了染色质免疫共沉淀实验(ChIP)。结果发现Bach1可以结合到Cyclin D1启动子 183到 1和MMP2启动子 232到 1区域。随后,我们对与Bach1结合的Cyclin D1和MMP2启动子序列分析,发现它们都存在一个TCF/lef识别位点T A/T(G/C)C A/T A A G。将这一位点突变后进行双荧光素酶报告实验,结果发现Bach1并不能抑制这些TCF/lef识别位点突变的启动子的活性。以上结果充分说明,Bach1通过直接结合到Cyclin D1和MMP2启动子上的TCF/lef识别位点抑制它们的转录。4、Bach1抑制Cyclin D1、MMP2的转录和GBM生长依赖于BTB结构域Bach1作为一个结合蛋白,往往不能直接结合到基因组的启动子上。我们通过大数据分析发现能同时识别并结合到Cyclin D1和MMP2启动子上TCF/lef识别位点的转录因子只有TCF4。随后,我们证实Bach1与TCF4在胶质母细胞瘤细胞中可以相互结合并且在293FT细胞中也存在外源性结合。Bach1存在两个蛋白结合的结构域,BTB结构域和bZip-CNC结构域。为了寻找发挥功能结构域,我们构建了缺失不同结构域的Bach1表达载体。我们利用免疫共沉淀实验发现Bach1与TCF4结合依赖于BTB结构域而不是CNC结构域。此外,将缺失不同结构域的Bach1表达载体与Cyclin D1和MMP2启动子报告载体共转到293FT细胞中,利用双荧光素酶报告实验发现Bach1抑制Cyclin D1和MMP2的转录依赖于BTB结构域。最后,我们利用MTT增殖和Transwell实验发现,Bach1抑制GBM细胞生长与转移的功能域也是依赖于其BTB结构域。这些结果表明Bach1抑制Cyclin D1和MMP2转录和GBM生长依赖于BTB结构域。5、激活经典Wnt通路可以挽救Bach1过表达引起的效应以往研究发现,Bach1可以抑制Wnt下游的IL-8和VEGF的表达进而诱导血管新生的减少。激活经典Wnt通路后,由Bach1引起的血管生成抑制得到恢复。Cyclin D1和MMP2又是经典Wnt通路的下游靶基因,因此我们检测了Wnt通路对Bach1的影响。我们利用Wnt3a激活经典Wnt通路后,由Bach1过表达引起的胶质母细胞瘤细胞增殖的抑制得到一定程度的恢复。同样的,激活经典Wnt通路后,细胞转移能力也得到了恢复。进一步的研究发现,激活经典Wnt通路减少了Bach1与TCF4的结合而不是抑制Bach1的表达。染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验结果显示,激活经典Wnt后,Bach1从Cyclin D1和MMP2启动子上分离出来,进而解除了Bach1对Cyclin D1和MMP2启动子活性的抑制。这些实验结果表明,激活经典Wnt通路解除了Bach1与Cyclin D1和MMP2启动子的结合,恢复了由Bach1过表达引起的生物学效应。6、Bach1是miR-155-5p的一个直接作用靶点为寻找Bach1在胶质母细胞瘤中的表达下降的具体作用机制,我们把关注点放在miRNA上。首先基于生物信息学及临床数据发现,在胶质母细胞瘤中,Bach1是miR-155-5p的一个潜在作用靶点。为验证这一推测,我们把与miR-155-5p结合位点的Bach1 3′UTR构建到pGL3-basic载体上,与miR-155-5p mimics和NC共转染到293FT细胞中,我们利用双荧光素酶报告实验发现,miR-155-5p可以结合到Bach1的mRNA上并抑制它的表达。此外,miR-155-5p可以促进细胞的增殖和转移。进一步通过对过表达miR-155-5p的U87细胞恢复表达缺失不同结构域的Bach1,利用MTT实验证明:在胶质母细胞瘤中,Bach1的BTB结构域起到的的功能域作用;Bach1是miR-155-5p的功能靶点。
【图文】：

蛋白,基本结构,结构域,家族

28]。Maf 的同源二聚体和 CNC-Maf 的异源二聚体都要结合到 Maf上[11]。Bach 家族成员都包含一个 BTB 结构域和 bZIP 结构域，其中是与其他蛋白结合的功能域[29-31]。Bach 蛋白最明显的特征是 BTB 结P 结构域的新颖组合，这是其他锌指蛋白家族和 bZIP 蛋白家族不具有TB 结构域的蛋白家族在果蝇的发育中发挥各种各样的作用，包括染色态发育、早期胚胎的特异起源、感光细胞的发育、神经连接的形成和2-34]。在这些最新鉴定的含有 BTB 结构域的蛋白中，Bach 家族是第一结构域的[1, 35]。Bach1 和 Bach2 作为用于具有功能性 NF-E2 位点的启调节因子，也可以抑制成纤维细胞的基因转录。与已知 CNC 家族蛋白作用不同，Bach 蛋白的转录阻遏活性是独特的[36, 37]。Bach 家族成员的结构和功能特点参与 MafK 的调控网络。因此，它们可以通过与小结合发挥转录激活或转录抑制的作用[38, 39]。总之，Bach 蛋白通过亮氨afK 或其他的 bZIP 蛋白形成异源二聚体结合到 DNA 上 TRE 或 NF-E2ach 蛋白还可以通过其 BTB 结构域与其他的蛋白相互作用[1, 40]（图 1

功能图,功能,氧化应激反应,细胞周期调控

图 1.2 Bach1 和小 Maf 异源二聚体的功能[12]Fig.1.2 BACH1/small Maf heterodimer and its function[12]值得注意的是，，为了研究参与 Bach1 在细胞代谢、氧化应激反应和细胞周期调控网络的先子，Warnatz 及其同事报道了一个独特的平台。他们使用三种不同的小干扰 RNA 在 HEK细胞中敲低 Bach1 表达，然后进行染色质免疫沉淀测序分析（ChIP-seq）。敲低 Bach1 后，们通过 ChIP-seq 发现了 59 个靶基因参与细胞功能的调控[5]（表 1.2）。表 1.2 Bach1 下游基因及功能1.2.2 Bach1 与血管生成Cellular processes Bach1 target genesHeme degradation HMOX1, FTL, FTH1, ME1, SLC48A1Redox regulation GCLC,GCLM, SLC7A11Cell cycle and apoptosis pathways ITPR2, CALM1, TFE3, EWSR1, CDK6, BCL2L11Subcellular transport processes CLSTN1, PSAP, MAPT, vault RNA
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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