iRGD肽修饰共载卡铂及Ce6脂质体介导声动力疗法抑制脑胶质瘤的研究

发布时间：2020-03-31 15:50

【摘要】：在人类神经系统中,脑胶质瘤[1]是其中发病率最高的脑部肿瘤之一。其特点为恶性程度较高,呈浸润性生长,手术治疗不易完全清除。放射性治疗极易损伤中枢神经,化疗药物不易到达脑肿瘤病灶部位,而且化疗药物在体内的分布没有选择性,在杀伤肿瘤细胞的同时也会伴随着正常细胞的死亡,治疗难度较大。而脑胶质瘤干细胞[2]则是脑胶质瘤中很小的一部分,是引发肿瘤的根源并同时维持着肿瘤生长。在适当的条件下可以分化成为新的肿瘤细胞,肿瘤发生,转移,复发的根本原因就在于此。因此,肿瘤治疗效果的关键之处就在于消除肿瘤干细胞,但对于肿瘤干细胞的治疗至今没有有效的治疗手段。考虑到其治疗方法的局限性我们采取了另一种治疗手段----声动力疗法。声动力疗法(Sonodynamic Tharapy,SDT)[3]是 1989 年日本学者 Umemura S[4]等人首次提出的一种利用超声激活声敏剂治疗肿瘤细胞的新方法。声动力疗法是超声波能够利用其自身的穿透力作用于肿瘤组织,激活声敏剂[5]从而产生对肿瘤组织的杀伤。应用SDT疗法声敏剂的选择是关键,本文研究中选择二氢卟吩e6即Ce6[6],是一种叶绿素降解衍生物。其优点在于具有较强的声动力反应能力,无毒,较高的肿瘤组织选择性及非肿瘤组织清除率高等。而在抗癌药物的选择方面本文研究中选择了抗癌药物卡铂(Carboplatin,CBP)[7]。其作用靶点不仅是细胞DNA,同时也会对RNA及蛋白质的合成产生抑制作用,属于周期非特异性抗癌药物。但大剂量给药时会产生神经毒性及各种不适反应。生物纳米技术[8]的出现可为抗癌药物CBP的毒性缺陷提供解决途径。以脂质体[9]作为携载抗癌药物的递送系统进入目标细胞,在高效治疗肿瘤的同时还可显著降低化疗药物的毒副作用。另一方面,通过文献了解到整合素α v β 3[10]在脑胶质瘤等肿瘤细胞表面有高表达,而iRGD肽[11]是能够与整合素αv 3特异性结合的短肽序列,由甘氨酸,精氨酸,天冬氨酸序列组成,是整合素与其肿瘤表面配体蛋白的识别位点。本课题讨论了一种药物靶向递送系统----靶向型脂质体[12]。在超声条件下,iRGD肽修饰并携载声敏剂Ce6与抗癌药物CBP的靶向共载脂质体,通过超声响应在特定时间,特定条件下释放药物,并从抗癌效果方面探讨靶向型脂质体对脑胶质瘤的杀伤效应。本文主要从靶向共载脂质体的合成,声控释药,体外细胞毒性效应,脑胶质瘤微球体的毒性效应评价等方面展开研究。并从四个方面进行概述:第一部份iRGD靶向肽修饰CBP、Ce6共载靶向脂质体的制备、表征及释药研究选择PEG化脂质体的标准制剂作为声敏剂Ce6和抗癌药物CBP的药物装载平台,Ce6装载到脂质体疏水脂质双分子层中,水溶性抗癌药物CBP则被包封在脂质体的亲水核心内。实验采用薄膜水化法[13]分别制备卡铂脂质体(CBP-L),二氢卟吩e6脂质体(Ce6-L),卡铂与Ce6共载脂质体(CBP-Ce6-L),iRGD肽修饰卡铂与Ce6共载靶向脂质体(iRGD-CBP-Ce6-L)。利用透射电镜观察其形态特征;马尔文Nano-ZS90动态光散射粒径分析仪检测不同脂质体粒径,电位及分散系数大小。结果显示:薄膜水化法制备脂质体操作步骤简单,结果稳定易重复。通过研究发现,四种脂质体分布均匀,粒径均在1OOnm-140nm,分布范围适中,带有少量负电荷,有效克服了抗癌药物卡铂临床应用中毒副作用强的问题。并可以在一定时间内稳定保存。第二部份iRGD靶向肽修饰CBP、Ce6共载靶向脂质体联合超声对人脑胶质瘤细胞(U87)的抗肿瘤效应研究选用人脑胶质瘤U87细胞为模型,采用MTT法、AnnexinV/PI等实验技术考察不同脂质体分别联合超声处理所产生的细胞毒效应。PI冻染结合流式细胞仪检测不同脂质体联合超声处理下细胞的DNA损伤情况。流式细胞仪结合荧光显微镜分析不同时间点细胞对靶向共载脂质体的摄取情况。实验结果表明:靶向共载脂质体联合超声处理对于U87细胞有着最强的细胞毒性,对其DNA也表现出最强的损伤程度。U87细胞对于靶向共载脂质体的摄取也随着时间的积累而增强。第三部份iRGD靶向肽修饰CBP、Ce6共载靶向脂质体联合超声对大鼠脑胶质瘤细胞(C6)的抗肿瘤效应研究选用大鼠脑胶质瘤C6细胞为模型,采用MTT法、AnnexinV/PI等实验技术考察不同脂质体分别联合超声处理所产生的细胞毒效应。PI冻染结合流式细胞仪检测不同脂质体联合超声处理下细胞的DNA损伤情况。流式细胞仪结合荧光显微镜分析不同时间点细胞对靶向共载脂质体的摄取情况。实验结果表明:靶向共载脂质体联合超声处理对C6细胞有着最强的细胞毒性,对其DNA也表现出最强的损伤程度。C6细胞对于靶向共载脂质体的摄取也随着时间的积累而不断增加。第四部份iRGD靶向肽修饰CBP、Ce6共载靶向脂质体联合超声对大鼠C6脑胶质瘤微球体的抗肿瘤效应研究在添加有生长因子的无血清培养基中接种大鼠脑胶质瘤细胞(C6)[14],待其长成微球体三到四天时传代换液。三到四周后微球体直径则可达到200-300um大小。当生长到合适大小时,采用MTT法、AnnexinV/PI等实验技术考察不同脂质体分别联合超声处理所产生的细胞毒效应。流式细胞仪检测大鼠脑胶质瘤微球体[16]对靶向共载脂质体随不同时间点的摄取情况。利用激光共聚焦显微镜拍摄超声前后靶向共载脂质体在微球体中的渗透情况来确定其脂质体的靶向效果。
【图文】：

示意图,示意图,叶绿素衍生物,卟啉类

图１．１超声原理示意图。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｕｌｔｒａｓｏｉｃ．逡逑而在ＳＤＴ治疗过程中，声敏剂［３８］的选择尤为关键。声敏剂在ＳＤＴ中关重要的作用，传统的声敏剂主要来源于光敏剂如卟啉类、卟吩类、氧物、植物提取物类等［３９］，当然还包括一些肿瘤药物［４Ｇ］，非甾体抗炎药等［４代卟啉类化合物是作为光敏剂广泛应用于光动力疗法领域的。但卟啉类是ＳＤＴ中最为常见的声敏剂类型，包括光敏素（Ｐｈｏｔｉｆｒｉｎ）、血卟啉（Ｈｐ）、血卟啉单甲醚（ＨＭＭＥ）及新型卟啉衍生物［４２］等。氧杂蒽衍生物是一类包括罗丹明和荧光素等。早期研究表明超声可以增强该类染料对肿瘤细组织的生长抑制作用，但此种化合物在肿瘤组织中富集量少因而限制了剂的发展１４４］。而近年来，大量抗癌药物也被运用于ＳＤＴ的抗肿瘤治疗中，（ＤＯＸ）是最为常见的抗肿瘤药物声敏剂。超声在其中的作用为增强其ＤＮＡ损伤、细胞凋亡、自由基的产生及空化效应等达到协同杀伤肿瘤的类药物［４５］联合超声处理也可以治疗肿瘤细胞。而在植物提取类声敏剂中，括姜黄素［４６］、叶绿素衍生物等。叶绿素衍生物是一类重要的声敏剂，且类属于其中一种。包括二氢卟吩ｅ６等，，该类声敏剂也同时具有良好的光

示意图,靶向,脂质体,示意图

逦陕西师范大学硕士学位论文逦逡逑体是一种人工合成囊泡，其磷脂分子的亲水头部插入水溶液中，疏水尾部伸入外逡逑部。即可形成双层脂分子的球形脂质体，其粒径大小在３０－１０００ｎｍ不等。由于脂逡逑质体可以和细胞相融合，进而可将药物送入细胞内部。而本实验设计的这种靶向逡逑型脂质体是将水溶性抗癌药物卡铂包裹于磷脂双分子的腔内，将脂溶性声敏剂二逡逑氢卟吩ｅ６嵌入磷脂双分子层的中间，最后将靶向肽ｉＲＧＤ连接在脂质体的表面并逡逑对脂质体进行表面的靶向修饰［８６］。即本实验中的靶向共载脂质体逡逑—ｉＲＧＤ－ＣＢＰ－Ｃｅ６－Ｌ。逡逑
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【参考文献】