骨骼肌细胞SNX17与LRP4分子表达分析

发布时间：2020-04-01 20:25

【摘要】：研究背景低密度脂蛋白受体相关蛋白4(Low-density lipoprotein receptor-related protein4,LRP4)抗体是一种新近发现的介导重症肌无力(myasthenia gravis,MG)发病的分子。而MG是一种已被许多学者公认的由自身抗体介导的免疫性疾病,由神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)的突触传递受损所致。80%的MG患者可检测到抗肌肉烟碱型乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor,AChR)AChR的自身抗体,约20%的MG患者是乙酰胆碱受体抗体阴性。最近,在2-27%没有AChR和MuSK抗体的患者中发现了LRP4的自身抗体,并且动物模型提示这些抗体的致病作用。目前关于MG终板膜的修复机制研究报道较为少见。而实验性自身免疫性重症肌无力动物模型(Experimental autoimmune myastheia gravis,EAMG)是研究MG的一种可靠的动物模型,是用于研究疾病机制和/或治疗该疾病的方法的重要工具,与人类中MG具有许多相似的免疫病理学和临床特征,包括血清中抗AChR抗体的存在,NMJ上Ig G和补体的沉积,以及肌肉AChRs的丧失。目前常用人工合成鼠源的AChR-α亚单位97-116多段(R97-116)制备EAMG模型。最近,SNX17已被鉴定为低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)受体家族的几个成员的结合配偶体,且在预防含有NPxY基序的β1整联蛋白、低密度脂蛋白受体和P-选择蛋白溶酶体降解中起重要作用。本课题组前期发现MG患者肋间肌肌细胞中分拣微管连接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)含量明显增高,并与AChR共定位于NMJ处,通过双向免疫共沉淀(Co-IP)及蛋白印迹(Western Blotting,WB)实验验证了原核表达的LRP4胞内区蛋白与真核表达的SNX17体外可发生直接结合,推测LRP4在MG患者NMJ处肌细胞内通过与SNX17结合,逃避了溶酶体的降解途径,直接插入细胞膜再循环利用,修复NMJ终板膜LRP4-MuSK-nAChR功能单元。为了了解肌细胞SNX17、LRP4的表达特点,本实验分别从细胞水平和动物水平运用WB、实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术进行分析。目的利用诱导C2C12细胞分化并给予处理及采用人工合成鼠源性AChR-α亚单位97~116肽段建立EAMG大鼠模型,运用WB、qRT-PCR技术分析SNX17、LRP4在不同骨骼肌细胞中的表达特点。方法1.原代C2C12细胞的分化及处理:从SD大鼠胎鼠(1-2天)提取C2C12成肌原代细胞,并用2%马血清诱导分化,然后分为空白对照组及实验处理组,分别给予加入AChR抗体阳性的MG患者血清处理(AChRAb组)及加入兔抗鼠的LRP4抗体(1:1000)处理(LRP4Ab组),并分别收集0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h时的处理细胞。2.EAMG实验大鼠模型的建立:采取主动免疫法。将20只健康雌性LEWIS大鼠(6-8周,体重150-160g),按照随机数字法随机分为两组,对照组10只,实验组10只。采用鼠源性AChR-α亚单位97~116肽段为免疫原诱导模型组LEWIS大鼠建立实验动物模型。正常对照组给予注射相同剂量的佐剂与PBS。初次免疫第30天及第45天分别于同等部位给予同等剂量免疫。第三次免疫一周后开始评价模型。以Lennon分级评分≥1分,ELISA法测定AChR-Ab呈阳性,同时低频(5Hz)重复电刺激后,腓肠肌肌电图在第5次出现衰减幅度大于10%为EAMG大鼠模型造模成功标准。3.qRT-PCR法检测肌细胞SNX17、nAChRβ1亚基、LRP4、MuSK分子mRNA含量:5%水合氯醛麻醉大鼠,取出眼肌、咀嚼肌、腓肠肌肌肉组织,预冷PBS洗涤2次,每组肌群各称取40mg肌肉液氮下匀浆,用Trizol一步法提取RNA,并按照反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA。Premier5.0设计引物,SNX17上游引物序列GACGACGATGTCATGGAGAA,下游引物序AGATTTGAGCTGTCGGTGCT,扩增产物长度117bp;nAChRβ1亚单位其上游引物为AGCCTGAACGAGAAGGATGA,下游引物为TGACACGGAGAGACTCGATG,扩增产物长度119bp;LRP4上游引物序列:GATGGTTCCTGTCGCAAAGT,下游引物序列,CGTTCAATCTTGGCAATGTG,扩增产物长度122bp;MuSK上游引物序列ACCCCAACATTGTGAAGCTC,下游引物序列AGTGTGAGGGGACATGCTTC,扩增产物长度119bp;β-actin作为内参,其上游引物序列为TGTCACCAACTGGGACGATA,下游引物序列为GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA,扩增产物长度165bp,均由上海生工合成。qPCR法采用20ul反应体系,荧光预变性反应条件为95℃30 S;PCR的反应条件为95℃5 S、55℃30S,45个循环。采用相对表达量2~(-△△ct)的方法算出各个目的基因的相对表达量。4.WB法检测肌细胞SNX17、LRP4、EEA1蛋白含量:取出上述各肌肉组织,加入RIPA细胞裂解液,冰上裂解30 min,在超低温离心机以12000 rpm的速度离心5 min,然后取上清,采用BCA法进行检测细胞蛋白的浓度,每个孔加入6ul样品,GAPDH作为内参,小鼠抗大鼠SNX17抗体(1:500)、小鼠抗大鼠LRP4抗体(1:1000)、兔抗大鼠EEA1(1:1000)及兔抗鼠GAPDH抗体(1:1000)一抗孵育4℃过夜,第二天37℃复温0.5 h,HRP标记的羊抗小鼠抗体(1:10000)和HRP标记的羊抗兔抗体(1:10000)37℃孵育1 h,然后曝光,采用图像分析软件Quantity One分别进行测定目的基因和GAPDH的显色条带平均值,各组蛋白表达强度为二者平均值的比值。结果1.细胞水平:成功诱导分化C2C12肌管细胞,与空白对照组相比,AChRAb组SNX17、LRP4基因表达含量均上调,差异显著均有统计学意义(p0.05),且随时间的增加表达增强,1.5小时之后组间比较无统计学意义(p0.05);LRP4Ab组SNX17基因表达含量降低,而LRP4基因表达含量升高,差异均有统计学意义(p0.05)。2.动物水平:按照EAMG大鼠模型成功造模标准,本次实验共纳入8只EAMG模型大鼠。基因检测结果显示,EAMG大鼠眼肌MuSK和nAChRβ1亚单位基因表达较正常组显著下降(p0.05),而咀嚼肌和腓肠肌中两者变化不大;LRP4、SNX17在三组肌群均无明显改变。WB结果显示,EAMG大鼠眼肌LRP4蛋白显著降低(p0.01),而EEA1蛋白表达增加(p0.05),但该蛋白在腓肠肌中表达下降(P0.01);腓肠肌SNX17蛋白含量增加显著(p0.01)。结论1.使用不同的MG自身抗体刺激,SNX17、LRP4在细胞水平呈现不同变化的特点,说明LRP4Ab和AChRAb引起的肌细胞反应是不一样的,LRP4Ab组SNX17、LRP4基因表达均增加,而AChRAb组SNX17基因表达含量降低,LRP4基因表达含量增加;2.动物水平AChRAb引起的眼肌、咀嚼肌和腓肠肌肌细胞SNX17、LRP4等终板膜相关蛋白变化不同,其中眼肌LRP4、MuSK和nAChRβ1亚单位表达均明显降低,SNX17蛋白在腓肠肌中表达显著增加,可部分解释AChRAb介导的重症肌无力易累及眼肌的原因。
【图文】：

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MuSK 基因在眼肌(n=5，0.25±0.02，p < 0.05)表达下调，其差异有统计学意义(见图 5)。2.3 蛋白水平结果EAMG 组较对照组 SNX17 蛋白在咀嚼肌（t=14.473，p < 0.01）、腓肠肌（t=3.788，，p < 0.05）表达增加，其差异有统计学意义；LRP4 蛋白在眼肌（t=-3.31，p < 0.05）表达降低，其差异有统计学意义；EEA1 蛋白在眼肌（t=4.87，p < 0.05）表达增加，而在腓肠肌（t=-6.26，p < 0.01）表达降低，其差异均有统计学意义（见图 6）。

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图1 A为SD大鼠C2C12细胞传代后第1天（100×），B为C2C12细胞传代后第2天（100×），C 为传代后第 3 天（100×），D 为诱导分化后第 1 天（100×），E 为诱导分化后第 2 天（100×），F 为诱导分化后第 3 天（100×）
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R746.1

【参考文献】