抑制代谢性谷氨酸受体5对缺氧状态下神经胶质瘤细胞存活率的影响

发布时间：2020-04-06 21:34

【摘要】：神经胶质瘤作为最常见的原发脑肿瘤之一,目前临床上治疗该病的方案包括一期肿瘤切除、烷化剂替莫唑胺化疗、放射治疗、靶向治疗、生物免疫治疗等。由于代谢旺盛,神经胶质瘤细胞微环境中普遍存在缺氧。缺氧环境下自由基生成减少,导致放疗效果变差。同样,缺氧状态会抑制肿瘤内药物的摄取、稳定和渗透过程,从而影响化疗的效果。因此,缺氧状态下神经胶质瘤的放化疗效果不佳。目前用于胶质瘤临床研究的分子靶向药物较多,如伊马替尼、吉非替尼、贝伐珠单抗等。但细胞信号传导通路复杂,不同通路之间存在交互作用,单一靶向药物治疗恶性胶质瘤作用有限。有互补作用的不同靶向药物的联合,靶向药物和细胞毒类药物如替莫唑胺,以及放疗的联合治疗或许是提高疗效的关键。越来越多的证据表明,代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor,mGluR)可调节和维持中枢神经系统细胞内稳态,在人类恶性肿瘤中同样发挥重要作用。代谢性谷氨酸受体是主要在中枢神经系统表达的G蛋白偶联受体,在神经元兴奋性和突触可塑性中发挥重要作用,并调节神经递质释放的反馈抑制。代谢性谷氨酸受体家族根据其序列同源性、药理学和相关第二信使信号通路分为三组。代谢性谷氨酸受体I型(mGluR1和mGluR5)信号由GTP结合蛋白(G蛋白)和下游第二信使,如环磷酸腺苷、二酰甘油和肌醇1,4,5-三磷酸介导。代谢性谷氨酸受体II型和III型信号通路主要是由Gi/O蛋白介导,可释放Gβγ亚单位来调节腺苷酸环化酶、离子通道和其他下游信号分子的活性。本研究第一部分观察了抑制/激活代谢性谷氨酸受体I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧状态下对人神经胶质瘤细胞存活率的影响。本研究第二部分进一步明确了缺氧状态下抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)降低人神经胶质瘤细胞存活率的原因,并进一步探索相关的信号通路及其对细胞存活率和线粒体氧化功能的影响。本研究第三部分为明确代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)在人神经胶质瘤细胞中的表达水平,收集了部分临床病例并展开了相关研究。第一部分抑制代谢性谷氨酸受体5降低缺氧状态下神经胶质瘤细胞存活率目的:观察抑制/激活代谢性谷氨酸受体I型(mGluR 1和mGluR 5)在常氧和缺氧环境下对人神经胶质瘤细胞存活率的影响。方法:常氧和缺氧两种状态下,我们分别用代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)特异性抑制剂MPEP(2-甲基-6-苯乙炔基吡啶)、代谢性谷氨酸受体1特异性抑制剂CPCCOEt(7-羟基亚胺环丙基[b]色氨酸-1a-羧酸乙酯)、代谢性谷氨酸受体I型(mGluR 1和mGluR 5)激动剂DHPG(3,5-二羟基苯甘氨酸)及空白对照对四种人神经胶质瘤细胞系:LNT-229、LNT-308、LNT-428和G55处理24小时,分别使用细胞毒性检测试剂盒(Roche)的乳酸脱氢酶(LDH)释放分析,使用碘化丙啶(PI)摄取染色,随后使用BD Canto II流式细胞仪评估缺氧和常氧环境下各组的细胞存活率。结果:常氧状态下,MPEP、CPCCEt或DHPG对四种人神经胶质瘤细胞系中细胞存活率没有影响。缺氧状态下,MPEP处理组乳酸脱氢酶释放量明显高于对照组、CPCCOEt组或DHPG组。常氧状态下,MPEP、CPCCOEt或DHPG对四种人神经胶质瘤细胞系细胞碘化丙啶(PI)染色没有影响。在缺氧状态下,MPEP处理组比对照组、CPCCOEt组或DHPG组更能诱导碘化丙啶(PI)染色。小结:缺氧状态下,抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)降低人神经胶质瘤细胞存活率。第二部分抑制代谢性谷氨酸受体5降低缺氧状态下神经胶质瘤细胞存活率与蛋白激酶B相关目的:为明确缺氧状态下抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)降低人神经胶质瘤细胞存活率的原因,我们进一步探索相关的信号通路及其对细胞存活率和线粒体氧化功能的影响。方法:使用比较阈值循环(2~(-△CT))方法将mRNAs的表达标准化为对照组,管家基因琥珀酸脱氢酶复合亚基A(SDHA)作为负荷控制,用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)和SYBR premix ex Taq II检测了在缺氧状态下经8小时MPEP、CPCCOEt或空白对照处理后LNT-229细胞线粒体氧化功能PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2、ATP5G1、MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2。用含磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀缓冲液裂解了缺氧状态下用MPEP、DHPG、CPCCOET或对照处理8小时后收集的LNT-229细胞,在十二烷基硫酸钠(SDS)载药缓冲液中煮沸溶解物,用SDS-PAGE分离蛋白质,在室温下用5%脱脂牛奶和Tween-20在磷酸盐缓冲液中阻断1小时后将其转移到硝酸纤维素膜,用初级抗体孵育硝酸纤维素膜作为装载控制,使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的二级抗体(1:10000)并使用增强化学发光(Pierce,IL,USA)检测抗原-抗体复合物。在缺氧状态下,分别用MPEP、蛋白激酶B激动剂(SC79)、MPEP+SC79及空白对照处理人神经胶质瘤细胞系LNT-229细胞24小时,分别使用细胞毒性检测试剂盒(Roche)的乳酸脱氢酶(LDH)释放分析,使用碘化丙啶(PI)摄取染色,随后使用BD Canto II流式细胞仪评估缺氧和常氧环境下各组的细胞存活率,同时按上文所述用RT-PCR方法测定线粒体氧化功能相关基因PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量。结果:在缺氧状态下,与对照组和CPCCOEt处理组相比,MPEP处理组增加PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1的含量,而MT-CO1、MT-CYB和MT-CO2的含量未受影响。在缺氧状态下的LNT-229细胞中,MPEP、CPCCOEt或DHPG处理不影响细胞外调节蛋白激酶蛋白(ERK)水平和磷酸化率(pERK/ERK),而与对照组、CPCCOEt或DHPG组比较,MPEP处理显著降低蛋白激酶B磷酸化(pAkt)水平。在缺氧状态下的LNT-229细胞中,与MPEP组比较,MPEP+SC79组细胞存活率显著升高。PGC-1a、PGC-1b、ERR-a、SCO2和ATP5G1含量降低。小结:在缺氧状态下抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)可增加部分线粒体氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆转了这一作用。这说明在缺氧状态下,抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)通过蛋白激酶B失活提高了线粒体氧化功能,降低了人胶质瘤细胞存活率。第三部分代谢性谷氨酸受体5在人神经胶质瘤细胞中的表达目的:为了明确代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)在人神经胶质瘤细胞中的表达水平,我们收集了部分临床病例并展开了相关研究。方法:我们收集了河北医科大学第二医院神经外科2018年6月至2018年12月间住院患者27例,术前均未接受放射治疗和化学治疗。所有患者术后病理均确诊胶质瘤。我们将每份临床标本分别取出癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘1cm)进行Westem blot检测,观察癌组织与癌旁组织中代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)的表达情况。结果:患者癌组织中代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)的表达高于癌旁组织。我们利用Western blot方法检测了代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)在患者癌组织和癌旁组织中的表达情况。与癌旁组织相比,癌组织中代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)的表达增高(P0.05)。小结:人胶质瘤细胞中可检测到代谢性谷氨酸受体5(mGluR5),与癌旁组织相比处于高表达水平,代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)可成为人胶质瘤临床治疗的潜在靶点。结论:1.缺氧状态下,抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)降低人神经胶质瘤细胞存活率。2.在缺氧状态下抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)可增加部分线粒体氧化基因的含量,抑制蛋白激酶B磷酸化。激活蛋白激酶B逆转了这一作用。这说明在缺氧状态下,抑制代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)通过蛋白激酶B失活提高了线粒体氧化功能,降低了人胶质瘤细胞存活率。3.人胶质瘤细胞中代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)处于高表达状态,代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)可成为人胶质瘤临床治疗的潜在靶点。
【图文】：

缺氧状态下，，MPEP对代谢性谷氨酸受体5的抑制增加了LDH的释放（%）

图 2 缺氧状态下，MPEP 对代谢性谷氨酸受体 5 的抑制增加了碘化丙啶（PI）染色（%）Fig.2 Inhibition of mGluR5 by MPEP selectively increased propidium iodide(PI) staining under hypoxia condition. (A-D) Cell lines LNT-229 (A),LNT-308 (B), LNT-428 (C) and G55 (D) were exposed to normoxia conditionfor 24 hrs. (A′-D′) Cell lines LNT-229 (A′), LNT-308 (B′), LNT-428 (C′) andG55 (D′) were exposed to hypoxia condition (0.1% O2) for 24 hrs. Data showmeans ± SEM. n = 5 experiments per group. Statistical significance wasdetermined by one way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.***P< 0.001
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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本文编号：2617052