DNMT1对MGMT启动子低甲基化状态人胶质瘤干细胞血管生成能力调控研究

发布时间：2020-04-06 23:34

【摘要】：胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)为原发性中枢神经系统肿瘤中最常见、治疗效果最差的一类恶性肿瘤。目前,多种治疗手段被应用于GBM的治疗,包括使用不同治疗靶点的单克隆药物、烷化剂化疗药物、放射治疗、肿瘤治疗电场(tumor treatment field,TTField)等。但是,即便在标准治疗方案基础上联合多种治疗手段,GBM患者的中位生存期仍然很短。GBM的特点之一是具有极丰富的供瘤血管。离体或动物实验均已证明,抑制肿瘤血管生成可以有效地控制肿瘤演进并延长生存期,但是目前临床应用的贝伐单抗(bevacizumab,BVZ)等抗血管治疗药物对原发性GBM的治疗效果并不理想。GBM干细胞(glioblastoma stem cell,GSC)是GBM中能够向多种成熟细胞类型分化的一类胶质瘤细胞,其对放疗、化疗耐受性强,并且具有较强的促血管生成能力。GSC在GBM演进过程中发挥重要作用,同时也是GBM复发的重要因素之一。因此,进一步了解GSC所具有的独特病理、生理学特性将为治疗GBM提供更广泛的思路。YKL-40和VEGF是两种重要的分泌型促血管生成因子,其在GBM促血管生成中的作用已被证实,但是它们在GSC促血管生成作用中的地位尚未明确。此外,GBM是一类具有高度异质性的肿瘤:根据基因表达普的不同其被分为四种类型,即:经典型(classical)、神经元型(neuronal)、前神经元型(Preneuronal)及间质型(mesenchymal);根据甲基化模式不同又被分为胶质瘤甲基化表型(G-CIMP)阳性和阴性两种。因此,根据胶质瘤类型的不同来细致了解各个类型胶质瘤的恶性特点对于GBM的精准治疗具有重要意义。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的启动子甲基化状态一直被认为是使用烷化剂药物治疗GBM的指征之一,MGMT启动子低甲基化意味着其对烷化剂化疗药物治疗敏感性低。但是目前发现MGMT启动子甲基化状态也与未应用烷化剂治疗的GBM患者的预后有关,提示不同MGMT启动子甲基化状态可能代表具有不同预后特点和恶性征象的GBM甲基化相关亚型。DNA甲基转移酶-1(DNMT1)作为维持基因组甲基化状态的重要酶之一,其表达的变化将直接影响全基因组的甲基化模式。那么DNMT1是否可以影响GSC的恶性特点?目前尚未有相关研究。【目的】1)探讨血清诱导干细胞分化后其血管生成能力的变化情况,并了解hGSC中YKL-40对VEGF表达的影响。2)探讨DNMT1对MGMT启动子低甲基化状态hGSC的血管生成能力的影响。同时探索DNMT1过表达对YKL-40与VEGF之间的关系的影响。【方法】1)运用标准干细胞分离、与筛选的方法从人GBM样本中提取干细胞,使用免疫荧光染色、PCR、Western blot对“干性”标记物进行检测。通过血清诱导干细胞分化,检测分化前后其促血管生成能力变化情况,了解YKL-40和VEGF的表达与分泌情况。检测实验选用的干细胞MGMT启动子甲基化水平,并使用慢病毒抑制hGSC的YKL-40表达,明确VEGF的表达变化情况。2)使用腺病毒上调MGMT启动子低甲基化状态hGSC的DNMT1表达,明确YKL-40、VEGF、MGMT的表达情况。随后在下调YKL-40的表达同时上调DNMT1的表达后,观察VEGF的表达情况。【结果】分离的hGSC高表达“干性”标记物,其促血管生成作用要强于分化后的hDGC。hGSC中YKL-40和VEGF表达高于hDGC。在MGMT启动子低甲基化的hGSC中,YKL-40可促进VEGF分泌。当上调DNMT1增加MGMT启动子低甲基化的hGSC的DNA甲基化水平后,hGSC的MGMT、VEGF、YKL-40表达均下降,此时降低YKL-40可以促进VEGF表达。【结论】本研究认为,hGSC较之一般分化的GBM具有更强的血管生成能力,并且这种能力与肿瘤自身特定的甲基化模式相关。DNMT1可以通过增加MGMT启动子低甲基化状态hGSC的甲基化水平降低肿瘤促血管生成能力及某些恶性特点。
【图文】：

图 1.3.1 A. 分离细胞株 WZ27、WZ31 克隆球照片； B. 免疫荧光检测克隆球CD133 和 Nestin 阳性； C. 血清诱导 hGSC 分化后 GFAP 染色阳性。1.3.2 血清诱导 hGSCs 分化为 hDGCs 后“干性”特点的改变干细胞培养基培养条件下两株细胞呈球样悬浮生长，而经过 10% FBS 处理后其可分化为普通 GBM 细胞，在此过程中其细胞形态发生明显的改变，并且会由悬浮生长状态变为贴壁生长状态（图 1.3.2A）。为了进一步确认我们分离的细胞株具有“干性特点并且可通过胎牛血清诱导分化，我们运用分子生物学方法检测了分化前后 GSC“性”标记物的表达变化情况。实时定量 PCR 结果显示，血清诱导 hGSCs 分化后，“干性标记物 CD133、Vimentin 和 Olig2 的表达明显下降（P<0.05）（图 1.3.2B）。为进一步认上述结果，我们使用 WesternBlot从蛋白水平检测了相关“干性”标记表达的变化情况与 PCR结果一致，诱导分化后干性指标 Nestin、Vimentin 和 Olig2 的表达出现了明显

1.3.2 A. 血清诱导分化前后细胞形态学变化情况； B. 诱导指 mRNA标表达变化情况，所有指标均明显下降（P<0.01）；干性指标蛋白水平的变化情况。s 诱导分化后血管生成能力改变 GSC 和 DGC 之间血管生成能力的变化，我们分别使用 养内皮细胞。CCK-8 结果显示，GSC 条件培养基培养的内于 DGC 条件培养基培养的内皮细胞，两组差异在第 3 天开.05）（图 1.3.3A）。使用流式细胞周期检测结果与细胞增殖 条件培养基培养的内皮细胞增殖指数（63%）明显高于 D%） (P<0.05)（图 1.3.3B）。随后我们检测了两组之间内。条件培养基处理 4 h始可观察到小管样结构形成，，同时小
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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本文编号：2617148