LOX在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成中的作用

发布时间：2020-04-07 12:03

【摘要】：动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH)作为脑血管疾病中的一种,约占所有自发性蛛网膜下腔出血的85%左右,严重威胁的人类的健康。aSAH发病凶险,病死率高,然而在通常情况下,很难预测颅内动脉瘤的生长和破裂,对发现和治疗造成了极大的困扰。近年来,结合形态学指标以及血流动力学参数采用数值模拟计算流体动力技术发现高壁面切应力与颅内动脉瘤的生长和破裂相关。血流动力学的变化仅仅是动脉瘤生长和破裂的始动因素,其如何通过“力学改变”进一步演化成为“病理改变”仍为该领域的一个难点。LOX(赖氨酰氧化酶)作为生物体内胶原纤维和弹性纤维活化和表达过程中一种重要的催化酶,其异常表达与血管壁破坏性重构的病理变化(血管壁细胞外基质的降解)密切相关。我们通过前期预实验(国家自然基金面上项目81471189)也发现LOX在动脉瘤患者中有异常表达。因此,我们进一步设计该实验来初步探索LOX在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成中的作用。目前国内外尚未见类似的研究。本研究的主要目的有二:1、细胞水平探索剪切力变化对内皮细胞LOX表达的影响;2、动物实验研究LOX与血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成之间的关系。第一部分细胞水平探索剪切力变化对内皮细胞LOX表达的影响目的:在细胞水平探索剪切力变化对大鼠内皮细胞LOX表达的影响。方法:提取原代SD大鼠颅内动脉内皮细胞进行培养,并将其分成静止组(0dyn/cm~2)、低剪切力组(12 dyn/cm~2)、正常剪切力组(24 dyn/cm~2)和高剪切力组(36dyn/cm~2),将其放入平行板流动小室内通过智能型蠕动泵给予稳定的剪切力刺激,培养24 h后测定LOX的mRNA表达情况,LOX蛋白水平的表达情况以及细胞凋亡的情况。结果:1、LOX蛋白水平的表达在各组间均存在统计学上差异。静止细胞少量表达,正常剪切力组表达最低(p0.05);低剪切力和高剪切力组有明显增加(p0.05),且在高剪切力作用下,表达最明显。2、LOX的mRNA表达在静止细胞中有少量表达,在正常剪切力作用下表达受一定程度抑制(p0.05)。高剪切力作用下,表达最显著(p0.05)。3、Cleaved-Caspase 3蛋白的表达水平,以静止组为参考时,低剪切力和高剪切力组表达均有增加(p0.05),而与正常剪切力组差异无统计学意义(p0.05)。当以高剪切力组为参考时,差异均有统计学意义(p0.05)。同时可以发现,在高剪切力作用下,Cleaved-Caspase 3蛋白的表达最明显。结论:在体外细胞实验中,LOX蛋白水平的表达在高剪切力作用下时显著升高;LOX的mRNA表达也显著升高;同时Cleaved-Caspase 3蛋白表达的增加也最为明显。提示高剪切力刺激导致LOX表达增加,并促进细胞凋亡。第二部分动物实验研究LOX与血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成之间的关系目的:1、用动物实验验证细胞实验的结果;2、构建干扰LOX表达的腺相关病毒,特异性干扰LOX的表达;3、研究LOX与血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成之间的关系。方法:1、SD大鼠66只,随机分成空白对照组(n=18)、假手术组(n=24)、模型组(n=24),建模组通过显微外科技术建立血流动力学模型;假手术组仅做血管探查,不做血管结扎;空白对照组不做任何处理;3个月后处死制备大鼠颅内供血动脉树脂铸型标本、免疫组化检测脑血管LOX蛋白水平的表达情况、Realtime-PCR技术测定LOX的mRNA表达情况;2、筛选外源有效RNAi载体并进行腺相关病毒包装,特异性干扰LOX基因表达;3、再次选取SD大鼠72只,随机分成模型组(n=24)、干扰组(n=24)和阴性对照组(n=24),所有大鼠均建立血流动力学模型,模型组仅单纯建模,干扰组给予尾静脉注射腺相关病毒,阴性对照组给予尾静脉注射阴性对照腺相关病毒,3个月后处死制备大鼠颅内供血动脉树脂铸型标本、免疫组化检测脑血管LOX蛋白水平的表达情况、Realtime-PCR技术测定LOX的mRNA表达情况。结果:1、模型组较假手术组以及空白对照组成瘤率明显升高,两者差异有统计学意义(p0.05),免疫组化提示脑血管LOX蛋白水平的表达明显增加(p0.05),Realtime-PCR技术测定LOX的mRNA表达明显增加(p0.05);2、构建腺相关病毒,表达良好,平均滴度为5.05E+12;3、给予腺相关病毒特异性干扰LOX表达后,脑血管LOX蛋白水平的表达以及mRNA的表达均有所降低(p0.05)。结论:在体动物实验结果总体变化趋势与细胞实验一致。高剪切力的刺激可以导致颅内动脉LOX基因表达的增加以及LOX蛋白水平表达的增加,同时导致颅内供血动脉瘤样改变,特异性抑制LOX基因的表达后LOX蛋白水平的表达以及mRNA的表达显著降低,瘤样改变可以得到有效的抑制。小结:高剪切力刺激可以导致LOX基因和LOX蛋白水平表达的显著增加,在细胞实验和动物实验中均得到了验证,体外细胞实验提示可以导致细胞凋亡,动物在体实验可以导致大鼠前交通复合体动脉成瘤率增加;特异性抑制LOX的表达后可以使成瘤率降低,对动脉瘤发生发展过程起到一定的抑制作用。本研究初步阐明了LOX与血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成之间的关系,后期可进行具体机制的研究,从而有望提高我国动脉瘤性蛛网膜下腔出血的防治水平。
【图文】：

剪切力,内皮细胞,实验过程,裂解液

不同剪切力刺激内皮细胞实验过程。 A 为生长在载玻片上大小的蠕动泵；C 为将载玻片放入 Parallel-PlateFlowCham为将整体放入恒温培养箱中。estern Blot 实验检测 LOX 蛋白水平的表达取总蛋白，我们将载玻片无菌取下后用 PBS 冲洗 2 次，用uffer 裂解，用细胞刮刮下细胞转入 EP 管中，将其放在冰上，然后用超声破碎细胞，参数为 200 W，共 4 次，每次持s；离心后结束后，用 BCA 法测定上清液的蛋白浓度。调整L，-80℃冰箱中。如果是组织的话采用如下方法：在干冰上钟内加入PMSF，采用等量的RIPA裂解液，使PMSF的最终 20mg 组织加入 150-250 uL 裂解液的比列冰浴裂解（因为考，因此我们适当减少了裂解液的用量，从而来保证获取高浓匀浆，待全裂解后，给予离心（参数：10000g，时间 5min，下冷藏，备用）；然后根据目标蛋白的分子量制备不同浓度

颅内动脉,免疫荧光,内皮细胞,大鼠

原代大鼠颅内动脉内皮细胞 vWF 免疫荧光鉴定。1：vWF；：倒置显微镜下内皮细胞生长情况。（×200））采用 western blot 检测不同剪切力刺激下，L情况部分研究中，根据既往相关研究结果，我们将实验分为静止组组和高剪切力组，并设置剪切力大小分别为 0 dyn/cm2、16dyn/cm2。用智能蠕动泵进行稳定的流量控制，在持续给予集载玻片上的细胞。分别以 Western blotting 检测各组 LOXern blotting（图 1-3）实验结果如下：LOX 蛋白水平的表达在异。以静止组为参考，低剪切力和高剪切力组 LOX 蛋白水p＜0.05），正常剪切力组 LOX 蛋白水平的表达有降低的趋正常剪切力与高剪切力和低剪切力组，两者比较有统计学较高剪切力组和低剪切力组，两者差异具有统计学意义（p
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

【参考文献】