难治性癫痫细胞模型SERCA表达及天麻素干预的研究

发布时间：2020-04-07 13:58

【摘要】：目的:研究SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白在难治性癫痫细胞模型中的表达,天麻素干预对难治性癫痫神经元SERCA2(ATP2a2)表达的影响,进一步探讨天麻素抗癫痫的机制。方法:新生乳鼠,75%酒精消毒后迅速断头取脑,分离出双侧海马,以神经元专用无血清培养基(neurobasal plus media)和B 27补充剂等体外培养海马神经元;第5天用抗NeuN免疫荧光法鉴定神经元并计算纯度;第7天,将培养的神经元随机分组为正常对照组(C)、模型组(M)、模型+1μM天麻素组(G1)、模型+10μM天麻素组(G2)、模型+100μM天麻素组(G3),模型+1 mM天麻素组(G4),倒置相差显微镜观察各组神经元的形态学变化。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测ATP2a2(SERCA2)mRNA的表达,Western blot技术检测ATP2a2蛋白及c-PARP蛋白的表达变化。结果:(1)难治性癫痫细胞模型出现神经元融合、死亡。(2)在模型组,凋亡指标c-PARP蛋白的表达明显上调(P0.01),天麻素可以降低凋亡指标c-PARP的表达(P0.05)。(3)相比于对照组,模型组ATP2a2(SERCA2)mRNA出现表达量降低(P0.05);100μM天麻素能显著上调ATP2a2(SERCA2)mRNA的表达(P0.05)。(4)ATP2a2蛋白主要在内质网表达,平均灰度值:正常对照组(1.0039±0.0027),模型组(0.4371359±0.1522186),模型+100μM天麻素组(0.9770±0.0323),正常对照组和模型组之间差异有统计学意义(P0.05),模型组和模型+100μM天麻素组之间差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.难治性癫痫模型存在SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白表达下调及神经网络变化。2.难治性癫痫细胞模型中存在神经元的损伤、凋亡。3.天麻素可以上调难治性癫痫细胞模型SERCA2(ATP2a2)基因及蛋白的表达。4.天麻素可以缓解难治性癫痫细胞模型的凋亡。5.天麻素可通过上调SERCA2(ATP2a2)表达来缓解难治性癫痫细胞模型的凋亡。
【图文】：

海马神经元,形态变化,胞体

第 2 章结果第 2 章结果2.1 倒置相差显微镜下体外培养海马神经元的形态学观察刚分离种植的海马神经元为圆形，透亮，无突起，呈单细胞悬浮状态（Figure1（a））；4-6 h 后，绝大部分海马神经元可以良好贴壁，少数神经元可有 1-2 个小突起长出。种植 6-10 h后 Plating media 全部换液为 Culture media。培养第 3 天，贴壁的海马神经元伸长出粗细不均的数个突起，胞体透亮，呈梭形、三角形等，相邻的神经元之间可有稀疏网络连接（Figure 1（b））。培养至第 5 天的海马神经元，生长状态良好，立体感和折光性明显，胞体增大，突起延长交织成网（Figure 1（c））。培养第 7 天的海马神经元，胞体增大饱满，有明显的光晕；神经元突起变多，轴突细长，神经元之间突起相互交织，形成稠密复杂但分布均匀的神经网络（Figure 1（d））。

海马神经元,神经元

第 2 章结果NeuN 蛋白存在于哺乳动物中枢神经系统中的大多数神经元的细胞核和质中，存在 46kDa 和 48 kDa 两个亚型[40]；除少数类型神经元（如小脑、视网膜感光细胞和 γ-运动神经元等）外，绝大多数神经元是强 NeuN 阳该蛋白质的结构仍然未知，蛋白质的功能也仍然不完全清楚，但 Anti-Neu个可靠的标记分裂后神经元的抗体，在识别组织培养和切片的神经元、测域的神经和胶质细胞比、研究神经元分化和评估神经元状态等方面，已经用了 20 年[41]。免疫荧光结果显示，明场视野下，细胞状态良好（Figure 2（共聚焦显微镜下，海马神经元胞体及胞质可采集到明显荧光信号（Figure 性对照组未见荧光。通过计算海马神经元纯度，，培养至第 5 天的海马神超过 92%，说明本实验中方法所培养的海马神经元纯度足够高，可以用治性癫痫细胞模型及后续实验。2.2 海马神经元的鉴定及纯度计算结果
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1

【参考文献】