PCSK9在缺氧诱导神经细胞凋亡中的作用与机制

发布时间：2020-04-08 03:45

【摘要】：缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)指脑组织部分或完全缺氧,脑血流减少或暂停所致的脑损伤,既发生于各种围生期窒息引起的新生儿脑损伤,也发生于冠心病,心肌梗塞,脑中风等引起的老年人缺氧损伤,也发生于其他的年龄段,是引起神经系统伤残的主要原因,也是常见的临床疾病。缺氧导致的神经细胞凋亡是其发生的重要原因之一。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一种分布和作用十分广泛的真核细胞转录因子,是低氧应答时基因表达和恢复细胞内环境稳定的关键因子。缺氧会导致HIF-1α表达增加,进而导致下游一系列基因表达变化,引发凋亡等生物学效应。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)也叫神经凋亡调节转化酶1(neural apoptosis regulated convertase 1,NARC-1),通过调节细胞表面低密度脂蛋白受体,进而在胆固醇代谢中发挥重要作用。前期研究发现PCSK9与神经细胞凋亡有关,且生物信息学分析PCSK9启动子区域有HIF-1α结合位点。氯化钴为一种低氧模拟试剂,常用于体外诱导细胞缺氧。本课题旨在研究缺氧是否通过调节HIF-1α表达进而上调PCSK9表达,从而促进神经细胞凋亡,进而探索缺氧导致神经系统损伤的机制。第一部分:氯化钴(Co Cl2)对PC12细胞PCSK9、HIF-1α表达的影响以及对PC12细胞凋亡的影响。目的:探讨氯化钴(Co Cl2)能否通过调节PCSK9、HIF-1α的表达影响PC12神经细胞凋亡。实验方法:分别用0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L的Co Cl2处理PC12细胞24小时后,用Western blot检测PC12细胞中PCSK9及HIF-1α蛋白的表达。用250μmol/L Co Cl2处理PC12细胞不同时间(0h、6h、12h、24h)后,Western blot检测PC12细胞中PCSK9及HIF-1α蛋白的表达。Hoechst33258染色以及流式细胞仪检测Co Cl2对PC12细胞凋亡的影响。结果:随着Co Cl2处理浓度的增高,PC12细胞中PCSK9的表达呈浓度依赖性增高,其中250μmol/L和500μmol/L的Co Cl2处理组增高较为显著;HIF-1α蛋白的表达呈浓度依赖性增高。其中250μmol/L和500μmol/L的Co Cl2处理组增高较为显著;同时,Co Cl2也能呈浓度依赖性增加PC12细胞的凋亡。与0h相比,随着Co Cl2作用时间的延长,PC12细胞中PCSK9的蛋白表达呈时间依赖性升高,其中以24h升高最为显著;HIF-1α蛋白的表达呈时间依赖性增高,其中以24h升高最为显著。小结:Co Cl2呈浓度和时间依赖性上调PC12细胞中PCSK9的表达和HIF-1α蛋白的表达;此外,它也能呈浓度依赖性促进PC12细胞的凋亡。第二部分:HIF-1α表达改变对PC12细胞PCSK9、HIF-1α的表达以及对PC12细胞凋亡的影响。目的:探讨HIF-1α蛋白表达的改变能否对PCSK9蛋白表达产生影响进而影响PC12细胞的凋亡。实验方法:设立空白对照组,浓度分别为0μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的HIF-1α激动剂DMOG共孵育250μmol/L Co Cl2,作用于PC12细胞24小时后,用Western blot检测PC12细胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表达;用Hoechst33258染色以及流式细胞仪检测DMOG对PC12细胞凋亡的影响。设立空白对照组,浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L的HIF-1α抑制剂YC-1共孵育250μmol/L Co Cl2,作用于PC12细胞24小时后,用Western blot检测PC12细胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表达;用Hoechst33258染色以及流式细胞仪检测YC-1对PC12细胞凋亡的影响。结果:随着DMOG处理浓度的增高,PC12细胞中HIF-1α和PCSK9的表达呈浓度依赖性增高,其中250μmol/L、500μmol/L与0μmol/L相比PCSK9及HIF-1α蛋白的升高较为显著;凋亡蛋白Caspase3及Caspase9表达呈浓度依赖性降低,PC12细胞的凋亡率也呈浓度依赖性降低,其中1000μmol/L的DMOG处理组降低最为显著;同时,随着YC-1处理浓度的增高,PC12细胞中HIF-1α和PCSK9的表达呈浓度依赖性降低,凋亡蛋白Caspase3及Caspase9表达呈浓度依赖性升高,YC-1也呈浓度依赖性增加PC12细胞的凋亡。小结:DMOG呈浓度依赖性上调PC12细胞中PCSK9的表达和HIF-1α蛋白的表达;此外,它也能呈浓度依赖性降低PC12细胞的凋亡。YC-1呈浓度依赖性下调PC12细胞中PCSK9蛋白的表达和HIF-1α蛋白的表达;此外,它也能呈浓度依赖性促进PC12细胞的凋亡。第三部分:PCSK9 si RNA对PC12细胞PCSK9的表达以及对PC12细胞凋亡的影响。目的:探讨PCSK9蛋白表达的改变能否对缺氧条件下PC12细胞的凋亡产生影响实验方法:用有效浓度的PCSK9 si RNA转染PC12细胞36h后,加入含有250μmol/L的Co Cl2的无血清培养基处理PC12细胞24小时。Western blot分别检测PC12细胞中PCSK9、HIF-1α、Caspase3及Caspase9蛋白的表达量;用Hoechst33258染色检测细胞凋亡、流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:将有效浓度的PCSK9 si RNA转染PC12细胞36h后,再用含250μmol/L的Co Cl2的无血清培养基处理PC12细胞24小时。Western blot检测发现转染PCSK9 si RNA组HIF-1α蛋白表达降低;Hoechst33258染色及流式细胞仪检测发现转染PCSK9 si RNA组凋亡明显被抑制。小结:PCSK9 si RNA抑制了250μmol/L的氯化钴引起的神经细胞的凋亡。结论:缺氧诱导HIF-1α的产生促进PCSK9的表达调控神经细胞凋亡。
【图文】：

PC12细胞,台盼蓝染色,浓度依赖性,活力

第 4 章实验结果低 PC12 细胞活力增加细胞缺氧损伤用的化学缺氧试剂，具有简单，方便易操作的特点。L 的浓液，使用之前进行稀释。台盼蓝为细胞活性染性以及细胞存活率。分别用 0μmol/L、 125μmol/L、oCl2处理PC12细胞24小时后，用台盼蓝溶液进行染，在倒置显微镜下观察。结果显示，，随着 CoCl2浓度的染色的细胞逐渐增多，细胞变小变圆皱缩突触收缩低 PC12 细胞活力，增加 PC12 细胞缺氧损伤。

PC12细胞,蛋白表达,处理组,细胞

图 4.2.1 不同浓度 CoCl2对 PC12 细胞中 *P <04.2.2 250μmol/L CoCl2处理 PC12PCSK9 表达用 250μmol/L CoCl2处理 PC12 细胞细胞中 HIF-1α和 PCSK9 中的蛋白表达理时间的增多，PC12 细胞中 HIF-1α和24h 处理组增加最为明显（图 4.5）。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742

【参考文献】