活体成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛中的作用

发布时间：2020-04-10 02:31

【摘要】：小神经胶质细胞作为中枢神经系统中的主要免疫细胞,具有分化状态与功能的高度可塑性。它们不仅在维持中枢神经系统稳态中的作用十分关键,而且参与多种神经相关疾病的发生和发展。有研究表明,小神经胶质细胞的形态和动态行为是其在不同生理与病理条件下分化状态的直观反映。使用活体显微成像技术,描绘小神经胶质细胞形态和动态行为的变化规律,将为直观地揭示其在不同疾病中的作用带来可能。目前,癌症威胁着人类的健康,而肿瘤转移是癌症极难根治的主要原因。由于脑结构及功能的复杂性,肿瘤脑转移具有治疗难度大、风险高、预后不良的特点。神经病理性疼痛是一种主要由神经系统损伤造成的慢性疼痛,在一些慢性疾病(如癌症中的骨缩、感染、自身免疫疾病、外伤、糖尿病等)的发展过程中也会伴随发生,极大地影响了病人的生活质量。然而,在这两种疾病的漫长发展过程中,小神经胶质细胞的分化状态是如何改变的,并且发挥怎样的功能,目前还并不清楚。本研究充分利用活体显微成像方法的优势,旨在对肿瘤脑转移及神经病理性疼痛这两种慢性疾病中小神经胶质细胞的形态和动态行为进行长时程监视,以期揭示其在这两种疾病发展中所发挥的作用。主要结果如下所示:(1)首先,我们通过双侧颅窗窗口实现了对小鼠黑色素瘤脑转移灶和正常脑组织的同时监视。经过长达3周的活体显微成像,我们观察到在黑色素瘤脑转移的发展过程中小神经胶质细胞的形态由静息状态下的典型分支状转变为活化的变形虫样。成像数据的定量分析结果显示相比正常脑组织,转移灶中的小神经胶质细胞的胞体直径增至其1.56倍,而细胞突起长度减少了1.68倍。这些细胞除了形态发生了变化外,细胞的数量及胞体的运动速度分别是对照组的1.57倍和2.36倍。此外我们综合小神经胶质细胞的胞体直径及细胞突起长度信息,提出了可更直观与全面反映小神经胶质细胞活化程度的参数“分支参数”。这些结果说明在肿瘤细胞接种后的第5天开始,大量的小神经胶质细胞已被活化,且随着肿瘤转移灶的发展至接种后第21天,它们始终保持着这一活化状态,且活化程度达到最高。(2)通过剔除小神经胶质细胞,我们证实它们参与了黑色素瘤脑转移灶的形成。同时这些小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移的发展中显著上调了MMP3的表达。其中,高达94%的小神经胶质细胞表达了MMP3,且相对肿瘤细胞,小神经胶质细胞表达的MMP3是其114.2倍。小神经胶质细胞MMP3表达情况与血脑屏障完整性及小神经胶质细胞活化参数的相关性分析显示,这些MMP3一方面作为刺激分子促进了小神经胶质细胞的活化,另一方面也参与破坏血脑屏障完整性从而实现对黑色素瘤脑转移发展的促进作用。(3)通过坐骨神经CCI损伤,建立了不同程度疼痛的小鼠模型,在实现腰椎L5段的脊髓窗安装后,经过长达2周的脊髓成像,我们观察到小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的动态变化。通过比较不同程度疼痛小鼠及疼痛小鼠左右两侧脊髓段中的小神经胶质细胞,我们发现,中重度疼痛小鼠脊髓中,小神经胶质细胞在疼痛损伤后第2天已开始活化,它们的形态更倾向于变形虫样。而且至疼痛损伤后第14天,这些细胞仍然保持着活化的状态,同时,细胞突起的运动速度降低,单位体积细胞数量是对照组的1.75倍。这些结果说明,疼痛损伤后,小神经胶质细胞能快速被活化,且疼痛发展过程中小神经胶质细胞持续的活化状态提示其与神经病理性疼痛的发展持久且漫长的特点密切相关。(4)最后,为了探究后肢感觉皮层是如何参与神经病理性疼痛的调控,通过无标记、高分辨的光声显微成像系统,我们对正常小鼠和疼痛小鼠的后肢感觉皮层血氧饱和度进行了成像,结果显示疼痛小鼠皮层血管中含氧血红蛋白的比例更高。血氧饱和度更高的现象说明,在疼痛小鼠中,后肢感觉皮层中正在进行活跃的物质和能量交换,因此需要更多的氧分,并提示皮层中小神经胶质细胞也可能处于活化的状态,从而参与了神经病理性疼痛的调控。综上所述,本课题使用活体显微成像技术监测到,随着黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛的发展,小神经胶质细胞能够被快速地活化,且在形态、动态行为及分布上有了显著性的改变,并通过传统生物学手段及光声显微成像技术,进一步揭示了其在这两种疾病中的作用,为相关机理研究提供了新证据,并为这两种疾病的治疗提供了新思路。
【图文】：

小神经胶质细胞

io-Hortega 发现的小神经胶质细胞。A，Pio del Rio-Hortega（1882-1945）；B，Rio-Ho支装小神经胶质细胞；C，吞噬过程中小神经胶质细胞的形态变化（A，具有粗大的；B，短小的细胞突起和膨大的胞体；C，肥大胞体及伪足；D 和 E，变形虫样及伪足了白细胞；G，吞噬了红细胞；H，脂肪滴细胞，I，正在进行有丝分裂的细胞）31。-1 Microglia discovered by Pio del Rio-Hortega. A, Pio del Rio-Hortega (1882-1945d microglia drawn by Pio del Rio-Hortega. C, Different morphology of microglia durintic activity (A, cell with thick, rough prolongations; B, cells with short prolongations cell body; C, hypertrophic cell with pseudopodia; D and E, amoeboid and pseudopodic form phagocytosed leukocyte; G, cell with numerous phagocytosed erythrocytes; H, fat-granule mitotic division)31.神经胶质细胞活化状态与功能密切相关。基于早期人们对小神经胶质细胞功发现，小神经胶质细胞能在外界刺激下转变成具有某种特定功能的活化细形态会发生显著性的改变32。随着显微成像技术的发展，人们观察到活化的质细胞相比监视状态下的细胞，运动等动态行为也有显著性的差别33。它们态和动态的变化，都能够作为评价小神经胶质细胞活化状态的标准。在 2el Nimmerjahn34等人在健康的小鼠脑组织中发现，小神经胶质细胞是高速动图 1-2 所示。它们通过其高度分支的细胞突起通过伸出和回缩持续扫描周围

小神经胶质细胞

华中科技大学博士学位论文，并让人们意识到其动态的重要性。在随后的研究中，不少研究者成像的方法揭示了小神经胶质细胞在不同微环境中的作用35-38，如伤的脑组织活体显微成像发现，小神经胶质细胞这种对损伤做出的应是依赖于 ATP 的；通过对中风的小鼠脑组织进行成像发现，小神择性地清除功能紊乱的神经元网络从而实现对脑组织的保护；而在育过程中，小神经胶质细胞能够诱导突触的形成；另外，通过对单长达 15 个月的成像发现，其在脑组织中的较长的生命周期与各种都有紧密联系。这些活体显微成像的结果揭示了小神经胶质细胞动脑组织微环境中的变化，从而实现正常监视或损伤修复和应急，，调化疾病发生发展等功能。因此，小神经胶质细胞的形态及动态的变化状态的改变。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5;R741

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