亚甲蓝对杏仁核电点燃癫痫大鼠的神经保护作用及其机制研究

发布时间：2020-04-25 22:58

【摘要】：癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,具有发作性、反复性、刻板性等特征,具有较高的发病率和致死率。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是各种癫痫综合征最常见的类型,以反复的自发性发作为特点,反复的癫痫发作会严重影响患者的工作、生活和学习,还常常造成癫痫患者并发认知功能的障碍,出现记忆力的下降,进一步加重患者的心理创伤。目前,三分之二的癫痫病人可以通过服用抗癫痫药物控制或减少癫痫发作,而剩余三分之一的患者抗癫痫药物治疗效果不佳,成为药物难治性癫痫。现阶段临床使用的大部分抗癫痫药物也仅能控制癫痫急性发作的症状,很少能延缓癫痫的形成进程,更不可能治愈癫痫。因此,寻找能够有效阻止癫痫形成并改善患者认知障碍的药物对于改善患者的生活质量有重要意义。癫痫发作可导致不同程度的脑损伤,表现为神经元的变性、坏死。加强癫痫继发神经元损伤机理及保护措施的研究已成为癫痫防治的重要环节,引发了广泛关注。癫痫的发病机制涉及兴奋性氨基酸毒性学说、氧化应激损伤、钙超载、能量失衡、炎症级联反应、凋亡相关蛋白的激活等,这些机制相互交错,相互影响,促进了癫痫的形成和发展。尤其是氧化应激损伤、炎症级联反应、程序性凋亡均存在于癫痫病灶、病灶周边及远隔受损的组织中,是导致神经元功能障碍乃至死亡的主要原因。因此,抗氧化应激、抑制炎症级联反应及凋亡已成为保护癫痫继发脑神经元损伤的重要方面。亚甲蓝(methylene blue,MB)是一种可溶于水的吩噻秦类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凋亡等多种生物活性。它凭借强大的亲脂性可快速通过血脑屏障,很容易在中枢神经系统内蓄积从而发挥直接的神经保护作用。研究证实,MB不仅对侧索性硬化、Leber视神经病变、缺血性脑卒、帕金森病都有神经保护作用,还可改善阿尔兹海默症患者的记忆能力,成为治疗轻度认知功能障碍的潜在药物。近些年来MB在临床中枢神经系统疾病的应用越来越普遍,但对癫痫的神经保护作用及机制尚未见明确报导。本实验采用电刺激杏仁基底外侧核(basolateral amygdala,BLA)建立自发性癫痫持续状态(self-sustaining status epilepticus,SSSE)和慢性点燃两种模型,观察MB在急性癫痫发作、癫痫形成及癫痫继发认知障碍中的神经保护作用,并对其中可能的机制进行了探讨,以期对新型抗癫痫药物或癫痫继发神经损伤保护剂起到补充的效果。第一部分杏仁基底外侧核电点燃大鼠癫痫模型的建立目的:采用不同的刺激参数对BLA进行电刺激,诱发SSSE模型和BLA慢性点燃模型,观察记录大鼠的后放电、痫性发作分级及脑电(electroencephalogram,EEG)等情况,总结模型制作过程中的经验教训,提高该模型在本实验室成功率,为新型抗癫痫药物或神经保护剂研发奠定模型基础。方法:将健康成年雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组15只。对照组(Control):不接受任何实验处理;假手术组(Sham):BLA植入电极,但不予以刺激;慢性点燃组(EP):BLA植入电极,予以慢性点燃诱导电刺激;急性癫痫发作组(SSSE):BLA植入电极,予以SSSE诱导电刺激。在立体定位仪的协助下,将Teflon绝缘材料制作的刺激电极植入至右侧BLA(前囟后2.2mm,旁开4.7mm,深8.5mm)。电刺激诱导前24h测定后放电阈值(afterdischarge threshold,ADT),符合规定的大鼠采用不同的刺激参数诱导慢性电点燃和SSSE模型。实验1,慢性电点燃模型的建立:符合ADT标准的Wistar大鼠给予每天1次的电刺激,刺激参数为500μA恒流电流,频率60Hz,波宽1.0ms,单向方波,持续1s。癫痫发作行为学等级根据Racine分级法评定,连续3d出现5级发作即认为大鼠点燃成功。每天观察记录每只大鼠点燃过程中发生的事件,包括电极脱落、死亡、发作等级、后放电持续时间等。实验2,SSSE模型的建立:符合ADT标准的Wistar大鼠给予总共25min的电刺激,刺激参数为700μA恒流电流,波宽为1ms,频率为50Hz的双向方波连续刺激100ms,以每秒2次的频率发放。结束后立即连接EEG记录系统。SSSE诱导成功的标准为:电刺激停止后出现的高幅(2倍基线)、高频(8Hz)、持续时间至少5s的后放电,此类型后放电持续或间断(1-3s)出现至少15min。SSSE诱导成功后观察记录每只大鼠脑电记录过程中发生的事件,包括电极脱落、死亡、后放电发放次数、持续时间和诱导SSSE成功率等,共计12h。结果:1.Control组和Sham组大鼠全程无癫痫发作。2.EP组慢性电点燃模型:对15只大鼠ADT测定,1只大鼠未引出明显后放电,另有2只大鼠ADT超过300μA,最终有12只大鼠ADT达标,进入后序慢性点燃诱导程序。在慢性点燃期间,1只大鼠发生电极脱落,1只点燃过程中死亡,1只大鼠在点燃过程中发生颅骨感染,造成后放电消失。此3只无法完成后续点燃,排除出实验。最终有9只大鼠经过22d被成功点燃,连续3d均发生5级发作,痫性发作敏感性长期维持。3.SSSE模型:对15只大鼠ADT测定,1只大鼠未引出明显后放电,另有1只大鼠ADT超300μA,最终有13只大鼠ADT达标,进入后序SSSE诱导程序。经过25min SSSE电刺激诱导,最终有9只大鼠成功诱导出SSSE,成功率为69.23%。1只未能成功诱导出SSSE,2只发生电极脱落,1只大鼠在此过程中死亡,死亡率为7.69%。EEG记录12h后,后放电发放次数为36.22±2.67次,后放电持续时间为53.44±6.26min。第二部分亚甲蓝对杏仁基底外侧核电刺激诱导SSSE大鼠的脑保护作用及机制研究目的:建立BLA诱导SSSE急性癫痫发作大鼠模型,观察MB对SSSE大鼠急性癫痫发作次数及累计时间的影响和对海马神经元损伤保护作用,并探讨可能的机制。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)50只为实验对象,随机分为4组。对照组(Control):不接受任何实验处理;假手术组(Sham):BLA植入电极,但不予以刺激;SSSE组:BLA植入电极,予以SSSE诱导电刺激;SSSE+MB组:SSSE建立后5min给予腹腔注射1 mg/Kg的MB。Control和Sham组各有12只大鼠,SSSE和SSSE+MB组各有13只大鼠。SSSE诱导过程同第一部分。诱导结束后连续记录EEG总计12h。通过EEG典型SSSE后放电次数及累计发作时间比较各组SSSE的严重程度。24h后对大鼠海马进行取材,酶联免疫法检测MDA/GSH含量,尼氏染色观察海马CA1区和CA3区神经元的损伤情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3、BCL2及BAX的表达。结果:1.SSSE组1只大鼠在诱发程中死亡,SSSE+MB组1只大鼠诱发SSSE失败,均排除出实验。至此,每组共有12只大鼠纳入后序实验。SSSE组和SSSE+MB组之间痫性放电次数差别具有显著性统计学意义(P0.01),累计发作时间差别具有统计学意义(P0.05)。Control组和Sham组大鼠未有癫痫发作。2.和Control组相比,SSSE组MDA的含量明显升高(P0.01),GSH含量明显下降(P0.01)。和SSSE组相比,SSSE+MB组MDA水平显著降低(P0.01),而GSH水平显著升高(P0.01)。MDA和GSH含量在Sham组和Control组没有统计学差异(P0.05)。3.和Control组相比,SSSE组海马CA1区和CA3区锥体神经元固缩,形态欠规则,且明显稀疏,存活神经元的数量显著减少(P0.01)。和SSSE组相比,SSSE+MB组神经元形态明显改善,神经元的丢失明显减少(P0.01)。Sham组神经元数量和Control组相比没有统计学差异(P0.05)。4.和Control组相比,SSSE组海马Caspase3表达升高(P0.05)。和SSSE组相比,SSSE+MB组海马Caspase3表达水平回落(P0.05)。与Caspase3相反,BCL2表达在SSSE组较Control组下降(P0.05),而在SSSE+MB组回升,和SSSE组比有统计学差异(P0.05)。BAX在各组大鼠中的变化趋势和Caspase3基本相同。第三部分亚甲蓝对杏仁基底外侧核慢性电点燃大鼠癫痫形成及认知功能的影响目的:建立BLA诱导慢性点燃大鼠癫痫模型,研究MB对癫痫的形成过程以及癫痫导致的认知障碍的影响。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)40只为实验对象,随机分为4组,每组10只。对照组(Control):不接受任何实验处理;假手术组(Sham):BLA植入电极,但不予以刺激;慢性点燃组(EP):BLA植入电极,每天予以点燃一次;MB+EP组:每天点燃前30min腹腔注射1mg/Kg的MB。BLA慢性电点燃大鼠癫痫诱导过程同第一部分。大鼠连续3d出现5级发作认为点燃成功。每天记录大鼠的痫性发作等级及ADD,直至EP组大鼠全部点燃。结束后进行Morris水迷宫实验评价各组大鼠的学习、记忆等认知能力。结果:1.重复测量方差分析表明,两组之间发作等级存在统计学差异(0.01P=0.0420.05),MB处理和时间无交互作用(P0.05),提示两组的变化趋势相同;两组之间ADD存在统计学差异(0.01P=0.020.05),且MB处理和时间存在交互作用(P0.05),提示两组的变化趋势不同。最终,经过20d的刺激,EP组9只大鼠全部被成功点燃,痫性发作敏感性长期维持;而MB+EP组第20d发作等级平均为4.44级。2.定位航行实验结果表明,四组大鼠的逃避潜伏期在实验的前两天都没有统计学差异(P0.05)。实验的3-5d,各组大鼠的逃避潜伏期均呈现比前两天缩短的趋势。与Control组大鼠逃避潜伏期相比,EP组大鼠的逃避潜伏期均延长(P0.05);MB+EP组大鼠的逃避潜伏期较EP组大鼠均缩短(P0.05),但与Control组相比仍延长(P0.05)。Sham组大鼠的逃避潜伏期和Control组比较无统计学差异(P0.05)。3.空间探索实验结果表明,EP组大鼠120s内穿越平台的次数明显少于Control组(P0.01);MB+EP组大鼠120s内穿越平台的次数较EP组次数增多(P0.05)。EP组大鼠在目标象限逗留的时间比Control组明显缩短(P0.01)。MB+EP组大鼠逗留的时间为较EP组增加(P0.05)。Sham组与Control组相比,大鼠的穿越平台次数和在目标象限逗留的时间均无统计学差异(P0.05)。第四部分亚甲蓝影响杏仁基底外侧核慢性电点燃大鼠癫痫形成机制研究目的:建立BLA诱导慢性点燃大鼠癫痫模型,研究癫痫形成过程中的炎性机制,探讨MB在癫痫形成过程中表现出的神经保护作用机制。方法:以健康成年雄性Wistar大鼠(180-230g)36只为实验对象,随机分为4组,每组9只。对照组(Control):不接受任何实验处理;假手术组(Sham):BLA植入电极,但不予以刺激;慢性点燃组(EP):BLA植入电极,每天予以点燃一次;MB+EP组:每天点燃前30min腹腔注射1 mg/Kg的MB。BLA慢性电点燃大鼠癫痫诱导过程同第一部分。大鼠连续3d出现5级发作认为点燃成功。每天记录大鼠的痫性发作等级及ADD,直至点燃组大鼠全部点燃。结束后对大鼠海马进行取材,Western blot检测炎症相关蛋白NF-ΚB、IL-1β及IL-6的表达。结果:NF-ΚB在Control组海马组织中正常表达,Sham组与其没有统计学差异(P0.05)。和Control组相比,EP组和MB+EP组中NF-ΚB表达明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。而MB+EP组和EP组相比,NF-ΚB表达明显下降(P0.05)。IL-1β及IL-6在各组的表达趋势和NF-ΚB一致。结论:1.本实验通过电刺激BLA成功建立了SSSE和慢性点燃两种模型。这两种模型都具有诱导或点燃成功率高,痫性发作稳定,可控性、重复性好等特点。痫性发作和癫痫形成过程与人类TLE类似,是研究人类TLE发病机制的理想模型。2.MB可有效缓解急性癫痫发作的严重程度,减少神经元的丢失,发挥神经保护作用,其神经保护机制可能和提升机体抗氧化应激损伤和抗凋亡能力有关。3.NF-ΚB、IL-1β、IL-6等炎性因子的上调参与了癫痫形成的病理生理过程,而MB可在一定程度延缓癫痫的形成并改善癫痫大鼠的认知,其神经保护作用可能和下调NF-ΚB等炎症因子的表达,减轻炎症反应有关。
【图文】：

过程图,电极植入,过程

图 1 电极植入过程Fig.1 Process of electrode implantationNote: (A) Mounted on a stereotaxic instrument. (B) Exposed skull and drilled. (C)Ground electrode and screws using to fix the dental cement. (D) Insert the stimulatingelectrodes. (E) Fixed the electrodes with dental cement. (F) Fixed the miniaturereceptacle.

示意图,系统连接,刺激器,大鼠

27图 2 大鼠头部电极端子、刺激器及脑电记录系统连接示意图Fig.2 Schematic diagram of wires connectionNote: The wires connected the miniature receptacle on the rat head with EEG recorderand stimulation isolators. Through the wires, the amygdaloid electrode was connected to aswitch. The plug was switched to the left to deliver the kindling stimulus, and switched tothe right to record EEG.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1

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