百日咳毒素在脑卒中后对小胶质细胞作用及机制的研究

发布时间：2020-04-29 20:10

【摘要】：[目的]探讨百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)对缺血性脑卒中后小胶质细胞的调节作用及其可能的机制。[方法]分为体外、体内两部分实验。体内部分:建立小鼠大脑中动脉线栓(Middle Cerebral Artery Occlusion,MACO)卒中模型,随机分为三组,每组12只鼠。治疗组:建立卒中模型后,予PTx400ng/d,溶于lml生理盐水腹腔注射干预,连续干预三天;对照组:建立卒中模型后,每日予lml生理盐水腹腔注射;假手术组:每日予lml生理盐水腹腔注射。分别在24、48和72h进行行为学评分,统计分析小鼠神经功能的损伤和修复情况。72h进行TTC染色检测梗死面积,并行免疫组化检测细胞凋亡及小胶质细胞的分布和激活,同时,采用Western blot实验定量检测细胞凋亡及小胶质细胞。体外部分:培养原代小胶质细胞,用脂多糖(LPS)刺激模拟卒中后小胶质细胞状态。随机分为三组,治疗组:LPS刺激后予PTx50ng/ml/d进行干预,连续干预三天;对照组:LPS刺激后每日予相同体积细胞培养基,正常对照组:每日予相同体积细胞培养基。用MTT及SRB实验检测百日咳毒素对卒中后小胶质细胞的存活和损伤的调节。ELISA实验检测百日咳毒素对卒中后小胶质细胞毒性因子释放的影响;细胞免疫荧光法检测百日咳毒素对卒中后小胶质细胞CX3CR1表达的调节。[结果]百日咳毒素治疗可减轻卒中后小鼠脑梗死面积,使之由52±12%降至34±8%(P0.05),并且可以加快神经功能损伤的修复,在72h时,LONGA评分由2.2分降至1.8分,而对照组仅由2.3分降至2.2分。免疫组织化学检测发现百日咳毒素可减轻脑卒中细胞凋亡,使Caspase-3阳性细胞数由对照组的83± 18个/mm2减少至52 ± 16个/Mm2(P0.05)。免疫组织化学检测还发现百日咳毒素还可减少小胶质细胞在梗死区的聚集和活化,Ibal阳性细胞数由对照组的 183±46 个/m2减少至 63±22 个/mm2(P0.05)。Western blot 也得到了与免疫组化实验一致的结果,在患侧鼠脑内,百日咳毒素的治疗显著降低了Caspase-3 的表达,条带灰度由 1.2±0.2 降至 0.78±0.06(p0.05)。PTx的治疗也减少了小胶质细胞在梗死区的聚集,条带灰度由1.1 ±0.16降至0.79±0.09(p0.05)。体外MTT结果提示百日咳毒素减少LPS刺激后小胶质细胞的增殖,吸光值由0.151±0.001降至0.088±0.001(P0.05);SRB的检测也得出相似的结果,百日咳毒素治疗后,吸光值由0.462±0.018降至0.426±0.02。ELISA实验结果显示:PTx还可减少IL-1β和TNF-α的释放,使吸光值分别由0.165±0.001降至0.091±0.0004和0.75±0.003降至0.46±0.005(P0.05)。并且PTx可减少CX3CR1在小胶质细胞上的表达,免疫荧光实验显示百日咳毒素治疗后,小胶质细胞CX3CR1表达的荧光强度减弱,由 0.043±0.003 降低至 0.025±0.003(p0.05)。Western blot 结果也提示CX3CR1 的表达降低,灰度值由 0.38±0.05 降至 0.29±0.04(p0.05)。[结论]用百日咳毒素治疗脑卒中,可通过降低趋化因子CX3CR1的表达,减少小胶质细胞在梗死区的聚集,减弱增殖能力,减少其对IL-1β和TNF-α的分泌,使卒中后脑梗面积缩小,神经功能恢复加快,对脑起到保护作用。
【图文】：

缺血性脑卒中,手术切口,栓塞,实验动物房

ＤＴＴ邋３．邋ｌｇ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ邋Ｂｌｕｅ邋４－６ｍｇ邋混匀后存于邋４°Ｃ。逡逑２、方法逡逑２．１、实验动物逡逑Ｃ５７ＢＬ６小鼠，雄性，８周大，重约２０－２５ｇ。购于北京华阜康生物科技股份有逡逑限公司。实验动物饲养在恒温（２２土１°Ｃ邋），有规律的光照（１２ｈ白天，１２ｈ黑天）逡逑的实验动物房内，所有的实验动物在手术前后均可以自由获取食物和水。逡逑出生７２ｈ内的Ｃ５７ＢＬ６小鼠，雌雄不限、体重不限，用于小胶质细胞的原代逡逑培养。实验动物饲养在恒温（２２土１°Ｃ邋），有规律的光照（１２ｈ白天，１２ｈ黑天）逡逑的实验动物房内。逡逑２．邋２、大脑中动脉线栓法（Ｍｉｄｄｌｅ邋Ｃｅｒｅｂｒａｌ邋Ａｒｔｅｒｙ邋Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，邋ＭＣＡ０）逡逑

栓塞,颈内动脉,进线,腹腔注射

显露右侧颈总动脉（Ｃｏｍｍｏｎ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，ＣＣＡ），ｌ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，ＥＣＡ）和颈内动脉（Ｉｎｔｅｒｎａｌ邋ｃａｒｏｔｉｄ邋ａｒｔｅｒｙ，，邋Ｉ脉，在颈总动脉结扎处与颈动脉分叉之间予显微剪取一切口，菌生理盐水冲洗后置于肝素中的线栓线（附１）沿颈总动脉视下可见栓塞线进入颈内动脉并向颅底方向进线，当栓线分叉处时，缓慢进线，且稍感到阻力时停止进线，此时栓线包绕颈内动脉分叉处丝线结扎并固定栓塞线，防止栓塞线脱术野，无活动性出血，恢复右侧颈部解剖结构，缝合切口，腹腔注射盐水补液。从栓塞成功时计时，６０ｍｉｎ后抽出栓塞待小鼠完全苏醒后放回笼中单独饲养，每天腹腔注射生理盐线的制作逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】