【摘要】：背景蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是指脑血管破裂后血液进入蛛网膜下腔的一种严重脑血管疾病。自发性SAH通常由颅内动脉瘤破裂引起,死亡率及致残率较高,给家庭和社会带来巨大负担。夹闭或栓塞动脉瘤防止再次出血,但SAH后脑损伤仍然继续,且目前尚无有效治疗方法。茶叶中茶多酚的主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin Gallate,EGCG)是一种抗氧化剂,其在中枢神经系统疾病中的保护作用已得到广泛研究,但在SAH中的作用却鲜有报道。目的从线粒体功能及自噬水平探讨EGCG对SAH后神经细胞损伤的保护作用。方法利用PC12细胞和氧合血红蛋白(Oxyhemoglobin,OxyHb)建立体外SAH模型,浓度50μM的EGCG作为干预治疗药物,将实验分组为Con组、SAH组和EGCG组,选取OxyHb作用后48h作为观察点。1.利用显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,Western blot测定caspase3蛋白水平,观察EGCG对SAH后细胞凋亡的的影响。2.使用JC-1试剂盒,荧光显微镜下观察细胞内线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,?ψm)及线粒体形态变化,使用DCFH-DA试剂盒观察细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的变化,用流式细胞术量化?ψm及ROS水平。利用Western blot检测蛋白Drp1的表达。观察EGCG对SAH后线粒体功能的保护作用。3.Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和Atg5,观察EGCG对SAH后自噬的影响。4.利用差速离心法分离提取细胞内线粒体,分别检测细胞线粒体及非线粒体蛋白Bax、Cyt c水平,观察EGCG是否通过内部线粒体途径发挥抗凋亡作用。结果1 EGCG抑制SAH后细胞异常增值和凋亡。正常PC12细胞有较长的树突,且能相互交联形成网络结构,而OxyHb作用48h后,细胞表现出明显皱缩和树突减少。细胞活力测定显示,与Con组相比,SAH组细胞活力明显增加(P0.01),EGCG组较SAH组减弱(P0.05),EGCG组较Con组降低(P0.05)。caspase3蛋白水平结果显示,SAH组较Con组明显升高(P0.01),EGCG组较SAH组下降(P0.01)。2 EGCG能够保护SAH后线粒体功能。2.1 EGCG抑制SAH后?ψm去极化。荧光显微镜观察可见,Con组细胞内红色与绿色荧光处于基础水平,而SAH组红色荧光减少,绿色荧光增加,EGCG组红色与绿色荧光又恢复到基础水平。流式细胞术量化显示,与Con组相比,SAH组细胞内?ψm降低(P0.01),EGCG组细胞内?ψm较SAH组升高(P0.01)。2.2 EGCG降低SAH后细胞内ROS水平。荧光显微镜观察发现,Con组细胞内绿色荧光较弱,SAH组绿色荧光增加,EGCG组绿色荧光较SAH组减弱。流式细胞术量化显示,与Con组相比,SAH组细胞内ROS水平升高(P0.01),EGCG组细胞内ROS水平较SAH组降低(P0.05)。2.3 EGCG保护SAH后细胞内线粒体形态。荧光显微镜观察发现,Con组细胞中较长的棒状线粒体占多数,并交织成网,SAH组部分线粒体碎裂,长的棒状线粒体减少,而EGCG组中线粒体形态趋于正常。Drp1蛋白水平测定显示,与Con组相比,SAH组表达量上升(P0.05),EGCG组表达量较SAH组降低(P0.05)。3 EGCG调节SAH后异常自噬。Beclin-1蛋白表达水平显示,与Con组相比,SAH组表达升高(P0.01),EGCG组较SAH组降低(P0.05),表明EGCG抑制了SAH后自噬的启动。与Con组相比,SAH后Atg5蛋白表达降低(P0.01),EGCG组Atg5蛋白表达较SAH组升高(P0.05),表明EGCG可能促进自噬体延续。4 EGCG调节SAH后凋亡线粒体途径相关蛋白水平。4.1细胞线粒体中凋亡线粒体途径相关蛋白水平。SAH组Bax蛋白水平较Con组升高(P0.05),Cyt c蛋白水平较Con组明显下降(P0.01);与SAH组相比,EGCG组线粒体中Bax蛋白水平下降(P0.05),Cyt c蛋白水平升高(P0.05)。4.2细胞胞浆中凋亡线粒体途径相关蛋白水平。SAH组Bax蛋白水平较Con组降低(P0.01),Cyt c蛋白水平较Con组升高(P0.05);与SAH组相比,EGCG组Bax蛋白水平升高(P0.05),Cyt c蛋白水平降低(P0.01)。结论SAH后EGCG通过抑制异常自噬流和改善线粒体功能,进而减少细胞凋亡而发挥神经细胞保护作用。
【图文】：
树突减少，提示 OxyHb 可能影响细胞的功能。Con 组 SAH 组图 1 显微镜下观察 PC12 细胞（×200）检测细胞活力结果如图 2，与 Con 组（0.40 ± 0.15）相比，，细胞活力显著升高（0.64± 0.25，P < 0.01 vs Con组），EGCG组（ SAH 组降低（P < 0.05 vs SAH 组）。提示 EGCG 抑制 SAH 后
结果1 EGCG 抑制 SAH 后神经细胞异常增值和凋亡。倒置显微镜观察PC12细胞的表面形态（图1），可以看出正常组细胞能形成树突，且能相互交联形成网络结构，而用 OxyHb 刺激 PC12 细胞建立 SAH 模型后，细胞表现出明显皱缩，树突减少，提示 OxyHb 可能影响细胞的功能。Con 组 SAH 组图 1 显微镜下观察 PC12 细胞（×200）MTT 法检测细胞活力结果如图 2，与 Con 组（0.40 ± 0.15）相比，OxyHb 刺激48h后PC12细胞活力显著升高（0.64± 0.25，P < 0.01 vs Con组）
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.35
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