小鼠脑内seipin基因的表达

发布时间：2020-05-08 09:08

【摘要】：目的:构建seipin基因全身性敲除小鼠,观察seipin基因缺失对小鼠生存状态及血糖水平的影响,明确seipin基因在小鼠脑内各部位的表达情况,为进一步研究中枢神经系统seipin基因缺失的影响提供新的思路。方法:1.在C57BL/6(wild type,WT)小鼠seipin基因序列的第5-8外显子插入LacZ报告基因和两侧带有LoxP位点的Neo抗性基因后与ZP3-Cre小鼠交配产生只含有LacZ报告基因的seipin~(+/-),seipin~(+/-)雌雄小鼠交配产生全身敲除seipin基因的seipin~(-/-)(knockout,KO)小鼠,运用半定量PCR鉴定小鼠基因型,实时荧光定量PCR验证seipin基因敲除率。2.比较不同年龄阶段的KO及其同窝对照小鼠体重、体型、存活率及血糖水平。3.通过实时荧光定量PCR评估成年小鼠脑内各部位seipin基因的表达水平;选取成年KO小鼠,制备大脑的冰冻切片,通过LacZ染色准确定位seipin基因分布部位。4.通过高架O迷宫、黑白箱、旷场实验检测成年KO及其同窝对照小鼠的焦虑情绪。结果:1.WT小鼠与ZP3-Cre小鼠交配产生只含有LacZ报告基因的seipin~(+/-),seipin~(+/-)雌雄小鼠交配后获得KO小鼠。通过半定量PCR鉴定小鼠基因型,并通过荧光定量PCR验证小鼠sepin基因敲除效率,结果显示seipin~(+/-)小鼠的基因敲除率可达35.1%(P0.01),而KO小鼠的基因敲除率可达到95.1%(P0.001),成功构建出seipin基因全身性敲除的小鼠模型。2.比较不同年龄KO及其同窝对照小鼠的体型,发现至5月龄时,几乎所有KO小鼠均出现明显肝肿大,但同年龄的WT小鼠未出现这一病理变化。比较不同年龄KO及其同窝对照小鼠的体重,结果显示随年龄增长,WT及KO小鼠体重均有所上升,1月龄、3月龄KO小鼠的体重较同年龄WT小鼠无明显差异,5月龄及以后,KO小鼠体重较WT小鼠明显增加,至11月龄时WT及KO小鼠体重均有一定程度下降,但此时KO小鼠体重仍较WT小鼠高。比较KO及其对照小鼠存活率,结果显示5月龄之前WT及KO小鼠的存活率基本一致,5月龄至9月龄,WT小鼠生存情况无明显异常,但此时KO小鼠的存活率会逐渐降低,9月龄之后,WT小鼠存活率略微降低,KO小鼠的存活率则会大大下降。检测不同年龄小鼠正常饮食的血糖情况,结果显示不同年龄WT小鼠血糖水平基本保持稳定,KO小鼠血糖随年龄增长逐渐增高。1月龄KO小鼠血糖已经较WT小鼠升高,之后随年龄增长,KO小鼠与WT小鼠血糖水平差距更加明显,11月龄KO小鼠血糖水平均略微下降,但仍较同年龄WT小鼠高。3.运用荧光定量PCR检测成年WT小鼠大脑各部位seipin基因表达水平,结果显示小鼠脑内seipin基因在海马的表达水平最高,皮层和小脑次之,SVZ、杏仁核、下丘脑也均有明显表达,并且通过LacZ染色可以准确定位seipin基因在大脑各部位、各核团的表达。4.检测成年KO小鼠的焦虑情绪,高架O迷宫试验中,KO小鼠在开放臂停留时间与WT小鼠相比降低33.1%(P0.05),黑白箱实验中KO小鼠在白箱停留时间较WT小鼠缩短26.4%(P0.05),旷场实验中KO小鼠在中央区停留时间较WT小鼠减少40.5%(P0.05),以上结果均表明成年KO小鼠已出现明显的焦虑情绪。结论:成年KO小鼠出现明显肝肿大,血糖水平明显升高,存活率大大下降。小鼠脑内seipin基因在海马的表达水平最高,皮层和小脑次之,SVZ、杏仁核、下丘脑也均有明显表达。另外,成年KO小鼠出现明显焦虑情绪,但目前尚不能确定焦虑情绪是否与脑内seipin基因缺失直接相关,仍需进一步验证。
【图文】：

小鼠模型,小鼠

山西医科大学硕士学位论文在 WT 小鼠 seipin 基因序列的第 5-8 外显子插入 LacZ 报告基因和两侧带有LoxP 位点的 Neo 抗性基因后与 ZP3-Cre 小鼠交配产生只含有 LacZ 报告基因的seipin+/-（图 1-1），seipin+/-雌鼠与雄鼠交配后产生 WT、seipin+/-、KO 三种小鼠（图 1-2）。待 1 月龄时剪取鼠尾通过半定量 PCR 鉴定小鼠基因型，只出现 400bp条带即为 KO 小鼠，只出现 175bp 条带即为 WT 小鼠，两者均出现，即为 seipin+/-小鼠（图 1-3）；另取小鼠脑部海马及 SVZ 组织，通过实时荧光定量 PCR 验证基因敲除率，结果显示 seipin+/-小鼠 seipin 基因敲除率可达 35.1%（P<0.01)，，KO小鼠的基因敲除率达到 95.1%（P<0.001)，成功构建全身敲除 seipin 基因的小鼠模型（图 1-4）。

小鼠,基因

全身敲除seipin基因小鼠的产生
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741

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