胶质瘤端粒酶逆转录酶基因可变剪接及G4链配体CX-5461的调控机制研究

发布时间：2020-05-11 15:06

【摘要】：背景:神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,其特征是具有局部弥漫浸润的高侵袭性,并始终保持较差的预后。然而,目前仅有极少数可靠的生物标志物可用于预测胶质瘤患者的疾病进程、治疗反应和结局。已有研究显示高端粒酶活性或hTERT启动子突变与人脑肿瘤的临床诊断及预后参数密切相关。有也研究提出,与肿瘤组织病理学和临床参数相关联,hTERT可变剪接体的表达可作为某些癌症患者的诊断或预后生物标志物。同时,端粒酶也因此成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点,并且hTERT可变剪接模式的调节将是一种治疗策略。随着活性hTERT m RNA转录体表达水平下降,端粒酶活性会降低。但hTERT可变剪接体的生物学功能和精确调控机制仍不清楚。研究表明,转化生长因子-β(TGF-β)和反义寡核苷酸处理改变了hTERT前体mRNA的剪切模式,可以抑制端粒酶活性。另一项研究证实,一种G-四链体配体12459可以在A549细胞中将hTERT-FL转换为β缺失hTERT转录体而降低端粒酶活性。在端粒单链悬端或c-myc基因启动子序列中已经广泛研究了G-四链体结构,并且证实了hTERT内含子6含有两个能够形成G-四链体的富含G的序列。同样,CX-5461作为rDNA转录抑制剂目前处于恶性肿瘤的I期临床试验中,据报道它能强烈地结合和稳定G-四链体结构并能在体外诱导ATM/ATR,DNA损伤。此外,BRACO-19和TMPyP4作为其他两种G-四链体配体在稳定G-链体结构及诱导端粒DNA损伤方面被广泛研究,也具有调节hTERT可变剪接模式的潜力。因此,我们首先分析hTERT可变剪接体及端粒酶活性对胶质瘤患者诊断及预后评估的价值。然后探究G-四链体配体对胶质母细胞瘤细胞系hTERT可变剪接模式的调节潜能,并进一步研究CX-5461对胶质母细胞瘤细胞的生物学功能。目的:用人胶质瘤样本及人胶质母细胞瘤细胞系来研究端粒酶逆转录酶基因可变剪接的临床意义及G4链配体CX-5461对其调控机制。方法:1、收集、冻存胶质瘤样本并整理临床资料与病理资料。2、对收集的胶质瘤样本及人胶质母细胞瘤细胞系总RNA提取并逆转录建立cDNA文库。3、通过RT-PCR检测胶质瘤样本及细胞系hTERT可变剪接体的表达并分析其临床意义。4、通过TRAP实验检测胶质瘤样本及细胞系端粒酶活性并分析其临床意义。5、通过免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测胶质母细胞瘤细胞相关蛋白的表达变化。6、通过MTT检测CX-5461对胶质母细胞瘤细胞的抑制率。7、通过细胞克隆实验检测CX-5461对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响。8、通过流式细胞术检测CX-5461对胶质母细胞瘤细胞周期及凋亡的影响。9、通过免疫荧光方法检测细胞端粒DNA损伤相关蛋白荧光强度。结果:1、RT-PCR结果显示hTERT-All在所有人类胶质瘤组织和细胞系中均有表达,hTERT-FL mRNA在约86.8%的GBM,73.9%的ODM和42.9%的OAM中可检测到。在胶质瘤瘤组织中检测到两种hTERT可变剪接体(hTERT+β和hTERT-β)。38例GBM病例中有33例,24例ODM中有17例,35例OAM中有15例表达hTERT+β转录体,其余31例仅表达出无功能hTERT-β转录体。hTERT+β转录体与hTERT-FL转录体的表达一致。当hTERT+β转录体与患者的临床变量相关联时,其存在与患者的年龄,KPS,肿瘤大小和WHO肿瘤等级显著相关(P0.05)。2、TRAP法检测96例胶质瘤组织标本,结果显示38例GBM患者肿瘤组织中有34例(89.5%),23例ODM患者肿瘤组织中有17例(73.9%),35例OAM患者肿瘤组织中16例(45.7%)表现出较高的端粒酶活性。统计分析结果显示,三种不同组织类型的胶质瘤端粒酶活性与hTERT-FL或hTERT+β转录体的表达一致。TA与患者性别或切除范围无关(P0.05)。而与患者年龄,肿瘤大小,KPS和WHO分级等显著相关(P0.05)。在年龄50岁的52例患者中有30例(57.7%)端粒酶活性阳性,而年龄≥50岁的44名患者中有37例(84.1%)端粒酶活性阳性。在肿瘤6cm的49例患者中有28例(57.1%)端粒酶活性阳性,而肿瘤≥6cm的47例患者中有39例(83%)端粒酶活性阳性。在KPS75的57例患者中有39例(59.6%)端粒酶活性阳性,而KPS≥75的39例患者中有33例(84.6%)端粒酶活性阳性。3、Kaplan-Meier评估显示,38例GBM患者表达hTERT+β的3年中位生存期为11.5个月,仅表达hTERT β的3年中位生存期为24个月;TA阳性患者的3年中位生存期为12个月,TA阴性患者的3年中位生存期为25个月。23例ODM患者表达hTERT+β或TA阳性的3年中位生存期为19个月,仅表达hTERT β或TA阴性的3年中位生存期为35个月。35例OAM患者表达hTERT+β的3年中位生存期为28个月,仅表达hTERT β的3年中位生存期为36个月;TA阳性患者的3年中位生存期为29个月,TA阴性患者的3年中位生存期为36个月。对于不同WHO组织级别胶质瘤缺乏hTERT+β转录体表达或TA的患者存在显着的生存获益(P0.05)。4、RT-PCR结果显示,CX-5461能够显著改变hTERT剪接模式,导致T98G和U251细胞中活化的hTERT+β转录体急剧下降(P0.05)。另外两个G-四链体配体TMPyP4和BRACO-19作用不显著。在T98G和U251细胞中,CX-5461可以导致活化的hTERT+β转录体以剂量依赖性方式逐渐减少,并且增加非活性的hTERT-β转录体的表达(P0.05)。CX-5461可以剂量依赖性方式导致hTERT-FL表达的显著降低(P0.05),而对hTERT-All表达没有明显影响(P0.05)。5、Western blot结果显示,CX-5461在T98G和U251细胞中仅能微弱下调hTERT蛋白表达,条带灰度值统计分析显示这种调控不具有统计学差异(P0.05)TRAP实验结果显示,CX-5461可以以剂量依赖性的方式抑制T98G和U251细胞端粒酶活性。6、MTT结果显示,浓度为0.05到25μM的CX-5461作用48小时后,T98G,U251对CX-5461表现出显著的剂量依赖性细胞毒性效应。C6细胞系对CX-5461表现出中等强度的剂量依赖性细胞毒性效应。而HEB细胞对CX-5461表现出的细胞毒性反应很弱。细胞克隆形成实验结果显示,与对照组相比,T98G,U251细胞的克隆数目随CX-5461药物浓度的增加而呈梯度显著减少(P0.05)。7、流式细胞术结果显示,CX-5461可诱导T98G和U251细胞出现G2/M期阻滞。Western blot结果显示CX-5461能够明显上调p53和p16蛋白的表达,而抑制cyclin D1蛋白的表达。8、流式细胞术结果显示CX-5461可诱导T98G和U251细胞发生细胞凋亡。Western blot结果显示CX-5461能够显著降低T98G和U251细胞Bcl-2的表达,同时上调cleaved caspase-3和Bax的活性。9、Western blot结果显示CX-5461可以诱导T98G和U251细胞γ-H2AX,53BP1和p-ATM表达明显上调。共聚焦显微镜观察免疫荧光双染细胞核中DNA损伤反应标志物γ-H2AX和p-ATM结果显示,CX-5461可以诱导T98G和U251细胞表达γ-H2AX和p-ATM并能与TRF1充分实现共定位,证明细胞DNA损伤反应发生在端粒DNA上。结论:1、人胶质瘤存在两种hTERT可变剪接体即hTERT+β和hTERT-β,hTERT+β可变剪接体与hTERT-FL可变剪接体表达一致,并且与高端粒酶活性相一致,有作为提示胶质瘤不良预后的生物标志的潜能。2、G-四链体配体CX-5461能够改变hTERT剪接模式,导致GBM细胞活化的hTERT+β及hTERT-FL表达下降,抑制GBM细胞端粒酶活性。3、G-四链体配体CX-5461对GBM细胞具有细胞毒性作用,可引起端粒DNA损伤反应,诱导GBM细胞出现G2/M期阻滞及发生细胞凋亡。
【图文】：

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All 在所有人类胶质瘤组织和细胞系中均有表达（图 4.1，图 4.2然后，我们使用 hTERT-FL mRNA 特有的一对引物，通过使行 PCR 分析。结果显示，，hTERT-FL mRNA 在约 86.8％的 GBM（ ODM（图 4.3）和 42.9％的 OAM（图 4.4）中可检测到。此外，在 h的 96 胶质瘤组织中，hTERT 可变剪接变体表达被进一步研究。（图 4.2, 4.3, 4.4），在肿瘤组织中检测到两种 hTERT 可变剪接体ERT-β）。然而，在所有人胶质瘤组织或 GBM 细胞系中未检测到α 38 例 GBM 病例中有 33 例（图 4.2），24 例 ODM 中有 17 例（M 中有 15 例（图 4.4）表达 hTERT+β转录体，其余 31 例仅表现出转录体。我们发现，hTERT+β转录体与 hTERT-FL 转录体的表达hTERT +β转录体与患者的临床变量相关联时，发现其存在与患者瘤大小和 WHO 肿瘤等级显着相关（表 3.1）。这些发现表明表达与胶质瘤的迅猛生长相关。

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图 4.2 胶质母细胞瘤肿瘤组织 hTERT 可变剪接体表达Figure 4.2 hTERT alternative splice variant patterns in GBMs. Thirty-three of38 (86.8%) GBM cases exhibited hTERT +β transcript, and the remaining cases onlyexhibited nonfunctional hTERT β transcript. Cases with hTERT +β transcript wereconsistent with the expression of hTERT-FL transcript.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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