SCA3患者皮肤成纤维细胞高尔基体形态变化与iPSCs的构建

发布时间：2020-05-12 12:16

【摘要】：背景脊髓小脑共济失调3型(Spinocerebellar Ataxia Type 3/SCA3)又称马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease/MJD),是常染色体显性遗传性脊髓小脑共济失调最常见亚型,在我国的患病率约为3~5/10万。该病是由位于14q32.1上的ATXN3基因CAG三核苷酸异常重复扩增引起的疾病,是目前已发现的9种由CAG三核苷酸重复扩增引起疾病中的一种。该病的主要临床表现为进行性加重的小脑性共济失调、步态不稳、动作笨拙,可伴有眼球震颤,吞咽障碍以及感觉异常等,当前尚无有效的治疗方法。SCA3的确切发病机制尚未完全阐明,既往的研究表明包涵体形成、蛋白质质量控制系统功能的异常、神经元轴突运输障碍、细胞氧化应激功能障碍、细胞自噬和凋亡的障碍、线粒体结构和功能的异常等均可能参与了SCA3的发病。高尔基体是真核细胞内重要的细胞器,主要参与对部分脂质以及内质网合成蛋白质的加工、修饰、分类、包装与运输,高尔基体在细胞尤其是神经细胞的物质运输中发挥重要作用。研究表明高尔基体结构和功能的异常参与了肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔兹海默病(AD)、脊髓小脑共济失调2型(SCA2)等神经退行性疾病的发病过程,高尔基体碎裂可能是细胞凋亡的不可逆病理表现。当前,在SCA3发病过程中,细胞高尔基体形态的变化以及高尔基体是否参与SCA3的发病过程鲜有报道。诱导多能干细胞(iPSCs)是一类与胚胎干细胞具有类似形态和生物学功能的细胞,是由日本科学家山中弥伸于2006年通过逆转录病毒转染体细胞重编程建立。与胚胎干细胞类似,诱导多能干细胞可在体外进一步分化为各类组织细胞,患者来源的i PSCs可为研究疾病的发病机制、药物筛选、基因编辑和细胞移植治疗提供理想的细胞模型。本研究通过检测SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞中ataxin-3蛋白、高尔基体蛋白GM130的表达情况,初步探讨了SCA3患者来源皮肤成纤维细胞高尔基体的形态的变化,并成功的构建了患者皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞(iPSCs),为后续分化获得患者来源的神经细胞用于进一步探讨该病的发病机制和药物筛选等奠定了基础。目的检测SCA3患者皮肤成纤维细胞中高尔基体形态的变化,构建患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)。方法1.采用机械分离法培养SCA3患者与健康志愿者的皮肤成纤维细胞;2.CCK8细胞活力检测试剂盒检测皮肤成纤维细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,分别采用配对t检验和两独立样本t检验进行数据分析;3.免疫荧光法标记皮肤成纤维细胞高尔基体蛋白GM130,观察高尔基体形态,计数高尔基体碎裂的细胞数,χ2检验进行数据分析;4.Western-blot检测皮肤成纤维细胞ataxin-3,GM130的蛋白表达,采用t检验进行数据分析;5.透射电镜验证皮肤成纤维细胞高尔基体形态的改变;6.采用仙台病毒转染的方法构建患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs);7.碱性磷酸酶染色、核型分析、免疫荧光、流式细胞、畸胎瘤形成等鉴定患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs);8.毛细管电泳法检测患者来源的iPSCs中ATXN3基因的表达情况。结果1.通过机械分离法法成功的建立了SCA3患者与健康志愿者皮肤成纤维细胞;2.患者来源的皮肤成纤维细胞表达突变的ataxin-3蛋白,与健康志愿者皮肤成纤维细胞相比活力降低(t=2.889,p=0.045),凋亡增加(t=-5.159,p=0.007),高尔基体碎裂增多(χ2=16.61,p0.01),GM130表达量降低(t=43.658,p0.01);3.SCA3患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)碱性磷酸酶染色阳性,具有正常的二倍体核型,高表达干细胞标志物OCT4、Nanog和TRA-1-60,在NOD-SCID小鼠体内能成功的分化为具有三胚层结构的畸胎瘤;4.患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)携带致病的ATXN3基因,CAG三核苷酸重复次数未发生改变。结论1.SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞高尔基体发生碎裂,高尔基体碎裂可能参与了SCA3的发病过程,为研究SCA3的发病机制提供了新的思路;2.成功的构建了SCA3患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs),可为进一步探讨SCA3的发病机制等提供理想的细胞模型。
【图文】：

皮肤成纤维细胞,活力,患者

图 1.1 皮肤成纤维细胞的培养皮肤成纤维细胞的培养。A 图：皮肤组织块及其迁移出的原代皮肤成纤维细胞；B 图：由皮肤组织块消化传代培养的皮肤成纤维细胞。2.2 SCA3 患者皮肤成纤维细胞活力降低采用 CCK-8 法检测 SCA3 患者与健康志愿者第 2、4、6、8、10 代皮肤成纤维细胞的活力（表 1.1），SCA3 患者的皮肤成纤维细胞活力随着传代次数的增加其活力快速降低，配对 t 检验结果表明 SCA3 患者与健康志愿者细胞活力有显著性差异（t=2.889，P=0.045），SCA3 患者皮肤成纤维细胞活力降低（图 1.2）。

皮肤成纤维细胞,活力检测

图 1.1 皮肤成纤维细胞的培养成纤维细胞的培养。A 图：皮肤组织块及其迁移出的原代皮肤成纤维细胞；B 图：织块消化传代培养的皮肤成纤维细胞。 SCA3 患者皮肤成纤维细胞活力降低采用 CCK-8 法检测 SCA3 患者与健康志愿者第 2、4、6、8、10 代皮肤胞的活力（表 1.1），SCA3 患者的皮肤成纤维细胞活力随着传代次数的力快速降低，配对 t 检验结果表明 SCA3 患者与健康志愿者细胞活力有异（t=2.889，P=0.045），SCA3 患者皮肤成纤维细胞活力降低（图 1.2
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.7

【参考文献】