MicroRNA-497通过靶向调控mTOR及Bcl-2增强胶质瘤对替莫唑胺的耐药性

发布时间：2020-05-13 21:32

【摘要】：胶质瘤作为中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,具有极强的侵袭性,当前胶质瘤患者的治疗存在高复发率和高死亡率这两大难题,预后较差。目前国内外公认的胶质瘤有效的治疗方案是根治性手术治疗配合术后放化疗,但即便接受正规的内外科联合治疗,其中位生存期也不超过12个月。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)作为第二代烷化剂,可通过诱导鸟嘌呤残基的甲基化从而诱导细胞凋亡,TMZ结合放疗治疗胶质瘤较单独放疗可明显改善胶质瘤患者预后,同时具有广泛的适用性及较小的毒副作用,基于以上优点,TMZ已成为胶质瘤治疗中的标准化疗药物。但仅有不超过一半胶质瘤患者对替莫唑胺敏感,机体先天及获得性耐药是制约患者对TMZ化疗效果的关键原因。因此,寻找一种治疗手段能有效抑制胶质瘤对TMZ的耐药性一直是当前神经外科领域的焦点和热点。MicroRNAs(miRNAs)作为一组内生的非编码序列,miRNAs可通过与目的基因3'-UTRs的不完全配对从而诱导目的基因m RNA降解。当前研究发现miRNAs所调控的靶基因在包括细胞增长、分化、转移及肿瘤生长在内的多种病理生理过程中扮演着重要的角色。近来研究表明miRNAs在肿瘤细胞对化疗药物耐药中发挥着关键的作用。例如miR-873可通过靶向调控Bcl-2从而改善胶质瘤对顺铂的耐药性,而miR-16可通过调控胶质瘤细胞凋亡从而改善胶质瘤细胞对TMZ的耐药性,继而表明miRNAs可作为一种有效改善胶质瘤耐药性的调节剂从而用于胶质瘤临床治疗。MiR-497作为一种广泛存在的miRNA,在大多数恶性肿瘤中,其可通过抑制细胞增殖和分化从而对肿瘤细胞产生抑制作用。有研究表明miR-497可通过抑制Bcl-2的表达从而诱导乳腺癌细胞凋亡,同时过表达miR-497可抑制体内外宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。目前miR-497与胶质瘤耐药性是否存在一定相关性尚未可知,本次研究将探讨miR-497与胶质瘤对TMZ的耐药性的关系及其可能的作用机制。本研究将从以下四部分进行讨论分析:1.人脑胶质瘤耐TMZ细胞株的建立及其生物学特性研究目的:分析不同人脑胶质瘤细胞株对TMZ的敏感性,建立体外耐TMZ的胶质瘤细胞株,研究胶质瘤对TMZ耐药的分子作用机制以及探讨改善胶质瘤耐药的有效方法,从而提高胶质瘤患者的预后。方法:计算不同胶质瘤细胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)对TMZ的半数抑制浓度(IC50);通过不同浓度梯度的TMZ作用于体外胶质瘤细胞,初始剂量为1u M/L,最高剂量为100 u M/L,从而获得相对稳定的耐TMZ细胞株,在光学显微镜下观察胶质瘤细胞生长状态,计算耐药细胞株的IC50及耐药指数(resistance factor,RF)。结果:不同胶质瘤细胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)对TMZ的IC50分别为54.8、149.6、496.1、349.2、94.8和264.8u M/L,选择IC50值相对较低的SF295和U87细胞作为后续实验研究对象;通过逐步增加TMZ浓度和周期性给药的方式,在体外成功建立起对TMZ具有稳定耐药性的SF295/TR和U87/TR细胞株,光学显微镜下可见耐药细胞株较亲代细胞体积增大,细胞核呈不规则形,同时细胞质内颗粒状物增加;SF295/TR细胞对TMZ的IC50值较亲代SF295细胞增加了6.4倍(分别为465.4±62.8u M/L和72.8±9.2u M/L),U87/TR细胞对TMZ的IC50值较亲代U87细胞增加了5.9倍,(分别为645.2±98.1u M/L和108.5±14.8u M/L)。结论:通过模拟临床TMZ的用药程序,成功建立起体外耐TMZ人脑胶质瘤细胞株SF295/TR和U87/TR,其耐药性稳定,浓度递增法是胶质瘤细胞产生获得性耐药性的重要环节。2.MiR-497对体外胶质瘤细胞耐药的影响目的:分析miR-497在耐药及敏感型胶质瘤细胞株中的表达差异,通过上调及下调miR-497在敏感及耐药型胶质瘤细胞中的表达,检测miR-497对体外胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响,探讨miR-497在体外胶质瘤细胞耐药中的机制。方法:检测miR-497在人正常星形胶质细胞系NHA及不同胶质瘤细胞株(SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251)中的表达;分析miR-497在SF295/TR和U87/TR细胞株及其亲代细胞株中的表达差异;通过感染pre-miR-497或anti-miR-497至胶质瘤细胞,上调或下调敏感及耐药型胶质瘤细胞中miR-497的表达,利用CCK-8法检测miR-497对体外胶质瘤细胞增殖的影响,荧光显微镜下观察细胞凋亡。结果:与NHA细胞相比较,miR-497在体外胶质瘤细胞中的表达均显著升高,胶质瘤细胞株中miR-497的表达与IC50值呈正相关;miR-497在SF295/TR和U87/TR细胞株中的表达较其亲代细胞明显升高;q RT-PCR检测结果表明,转染pre-miR-497后SF295和U87细胞中miR-497表达量较转染前明显升高,而转染anti-miR-497至SF295/TR和U87/TR细胞后可明显下调miR-497表达;上调miR-497的表达可促进体外SF295和U87细胞增殖,并抑制细胞凋亡;下调miR-497的表达可抑制体外SF295/TR和U87/TR细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论:(1)MiR-497在胶质瘤细胞中的表达强弱与其耐药程度相一致;(2)MiR-497在胶质瘤耐药细胞中的表达较亲代细胞明显升高;(3)过表达miR-497可促进体外胶质瘤细胞增殖,并抑制细胞凋亡,而下调miR-497的表达可抑制体外胶质瘤细胞增殖,同时促进细胞凋亡。3.验证miR-497潜在靶点及其对体外胶质瘤细胞耐药的作用。目的:寻找miR-497潜在靶点,并探讨其潜在靶点对体外胶质瘤细胞耐药中的作用,以期为胶质瘤靶向治疗开辟新的途径。方法:通过运用生物信息学工具RNAhybrid 2.1、Target Scan和Pic Tar对miR-497靶基因进行预测,western blot法检测miR-497对体外胶质瘤细胞中靶基因蛋白表达的影响;利用CCK-8法检测靶基因对体外胶质瘤细胞增殖的影响,荧光显微镜下观察细胞凋亡。结果:运用生物信息学工具综合测定mTOR和Bcl-2与has-miR-497存在潜在的结合位点;western blot实验证实miR-497可正向调节mTOR和Bcl-2在胶质瘤细胞中的表达;下调mTOR和Bcl-2在耐药胶质瘤细胞中的表达可抑制体外胶质瘤细胞生长,并促进细胞凋亡。结论:MiR-497可正向调节mTOR和Bcl-2在体外胶质瘤细胞中的表达,抑制mTOR和Bcl-2在体外耐药胶质瘤细胞中的表达可逆转胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。4.MiR-497对体内耐药型胶质瘤细胞生长的影响。目的:通过体内实验,验证miR-497对体内耐药型胶质瘤生长的作用,进一步探究miR-497作为耐药型胶质瘤生物学靶向治疗的可行性。方法:稳定转染lenti-anti-miR-497至胶质瘤U87/TR细胞株,对照组U87/TR细胞转染lenti-anti-NC;建立裸鼠人脑胶质瘤皮下移植瘤模型;通过q RT-PCR检测miR-497在体内胶质瘤中的表达;免疫组化法检测Ki-67在皮下移植瘤组织中的表达;Tunel法检测肿瘤细胞凋亡;western blot检测mTOR和Bcl-2的表达。结果:与对照组相比较,anti-miR-497组皮下移植瘤生长明显减缓;anti-miR-497组胶质瘤中Ki-67的阳性表达率较对照组明显降低,细胞凋亡明显增加,同时mTOR和Bcl-2的表达显著降低。结论:MiR-497低表达可有效抑制体内耐药型胶质瘤生长,miR-497有望成为耐药型胶质瘤治疗的作用靶点。综上所述,本次研究结果表明miR-497作为一种胶质瘤促癌基因,与体内外胶质瘤对TMZ的耐药性联系密切,同时mTOR和Bcl-2作为miR-497可能潜在靶向基因在胶质瘤对TMZ获得性耐药中也发挥了一定作用,从而表明miR-497有望成为胶质瘤耐药的新的治疗靶点。
【图文】：

oRNA-497 通过靶向调控 mTOR 及 Bcl-2 增强胶质瘤对替莫唑胺的耐药性 第87 细胞作为后续实验（图 1-1A）。表 1：CCK-8 法检测不同浓度 TMZ 对 6 种胶质瘤细胞的增殖抑制作用μ M/L) 0 5 50 100 250 500 1000(OD 值) 1.485±0.357 1.047±0.286 0.915±0.247 0.804±0.248 0.517±0.138 0.377±0.086 0.2614(OD 值) 1.581±0.416 1.286±0.361 1.207±0.249 1.176±0.313 0.954±0.232 0.685±0.127 0.559OD 值) 1.253±0.294 1.181±0.206 1.034±0.253 0.986±0.217 0.964±0.239 0.953±0.274 0.657(OD 值) 1.594±0.342 1.296±0.235 1.196±0.211 1.069±0.234 0.863±0.142 0.847±0.188 0.716D 值) 1.652±0.343 1.428±0.241 1.206±0.249 0.987±0.268 0.876±0.196 0.547±0.113 0.449OD 值) 1.186±0.178 1.034±0.236 0.967±0.312 0.895±0.267 0.879±0.227 0.634±0.176 0.579

1-2：在光学显微镜下观察亲代 SF295 细胞（A）及 SF295/TR 细胞（B）（×42.3 比较耐药型胶质瘤细胞与亲代细胞对 TMZ 的 IC50 值培育成功 SF295/TR 和 U87/TR 细胞后，利用 CCK-8 法检测 TMZ 对两种细胞殖抑制作用，，检测结果如表 2；SF295/TR 和 U87/TR 细胞对 TMZ 的 IC50 分别5.4 和 645.2 uM/L；如图 1-1B 所示，SF295/TR 和 U87/TR 细胞的 IC50 与各自亲胞相比较，差异有统计学显著性（P < 0.001），其 RI 指数分别为 8.49 和 6.81。表 2：CCK-8 法检测不同浓度 TMZ 对 SF295/TR 和 U87/TR 细胞的增殖抑制作(μ M/L) 0 5 50 100 250 500 100095/TR (OD 值) 0.927±0.196 0.907±0.246 0.867±0.218 0.843±0.169 0.784±0.158 0.724±0.128 0.531±/TR (OD 值) 1.108 1.086±0.209 1.027±0.186 0.997±0.259 0.968±0.210 0.942±0.185 0.712± 讨 论近年来随着外科手术器械、显微外科手术技巧及神经导航技术的兴起和发展
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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本文编号：2662576