甲酯化脂氧素A4对脑出血的神经保护作用及其机制研究

发布时间：2020-05-15 06:05

【摘要】：背景:脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是急性脑血管病中死亡率最高的疾病,而且易遗留运动认知等多方面的功能障碍,给患者带来极大痛苦,增加了社会负担。尽管对脑出血发病机制进行了诸多研究,但进展有限,尚未转化为明显的临床获益。探讨脑出血早期病理变化及影响因素,寻找积极有效的治疗方案,可能抓住治疗时间窗提高疗效。近年来的研究发现,脑出血早期血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性增加诱发脑水肿等继发性脑损伤,是导致脑出血不良预后的主要原因。在此过程中,伴随炎症、氧化应激和凋亡因子的激活,以级联反应模式,互相影响,加剧了脑组织结构及功能损伤。因此加强对以上影响因素的研究,可能为脑出血的治疗寻找到潜在的新方向。脂氧素(Lipoxins,LXs)是由脂氧合酶作用于花生四烯酸后生成的一种内源性活性介质,脂氧素A4(Lipoxins A4,LXA4)是其主要生理活性形式之一,在各种炎症相关性疾病方面发挥抗炎和促炎症消退的作用。内源性脂氧素在脱氢酶的作用下迅速失活,不稳定,因人工合成的活性更稳定的脂氧素类似物即甲酯化脂氧素A4(lipoxin A4methyl ester,LXA4 ME)被广泛应用于实验研究。病理状态下,脂氧素通过抑制炎性细胞的募集和活性氧生成,调节小胶质细胞活性,下调基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表达等途径,在慢性神经退行性病变、缺血再灌注脑损伤、脑创伤等神经系统疾病中,发挥着十分重要的作用。但脂氧素对脑出后继发脑损伤的神经保护作用,尤其对脑出血早期的影响及有关调控机制尚不清楚。目的:探讨LXA4 ME对大鼠脑出血早期继发性损伤的神经保护作用及相关调控机制。方法:1.通过自体血建立大鼠ICH模型,侧脑室注射药物LXA4 ME(低剂量组:10ng/ul,高剂量组:100ng/ul)治疗,术后1-5天通过改良神经严重程度评分(Modified neurological severity score,MNSS)和转棒试验评估大鼠神经功能恢复情况。于术后24h处死大鼠取脑,通过HE染色和尼氏染色,观察脑组织病理形态变化和神经细胞存活情况;尼式染色观察ICH后24h血肿周围脑组织神经元密度。通过脑组织含水量及伊文思蓝(Evans blue,EB)测定,评估ICH后1-3天血脑屏障的通透性变化。2.通过末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记(Terminal-deoxy nucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)法检测细胞凋亡;Western-blot检测ICH后血肿周围区受损脑组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65和BBB通透性相关因子MMP-9、Occludin、闭锁小带蛋白(Zonulaoccludens1,ZO)-1的表达;凝胶酶谱电泳分析检测MMP-9的活性。探讨甲酯化脂氧素A4在脑出血中的抗炎及降低血脑屏障通透性的作用机制。3.给予丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)干预,通过MNSS和转棒试验评估大鼠神经功能障碍情况;TUNEL法检测神经元凋亡;Western-blot及RT-PCR检测ICH后血肿周围区受损脑组织中炎症因子NF-κBp65,线粒体功能相关蛋白腺嘌呤核苷酸转运子-1(Adenine nucleotide translocator-1,ANT1),融合蛋白2(Mitofusin 2,MFN2),凋亡相关因子细胞色素C(Cytochrome,CytoC),Bcl-2/Bax,caspase-3的表达;同时检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)及线粒体膜电位,评估线粒体功能障碍情况。结果:1.大鼠ICH后神经细胞肿胀,神经元数量减少,血脑屏障通透性和脑含水量增加,神经运动功能障碍(P0.05)。给予LXA4 ME治疗,可以改善神经元形态学变化,减轻脑水肿,改善ICH大鼠神经功能障碍(P0.05),起到神经保护作用,且该作用呈剂量依赖性。2.大鼠脑出血后,血肿周围区域神经元凋亡增加(P0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65、MMP-9表达增加(P0.05),而Occludin、ZO-1的表达减少(P0.05),MMP-9的活性增加(P0.05)。LXA4 ME通过NF-κB/MMP-9通路抑制炎症反应、减少神经细胞凋亡,降低血脑屏障通透性。3.通过PMA激活NF-κB,促进了神经功能损伤,增加神经元凋亡(P0.05);降低ANT1、MFN2、Bcl-2的蛋白和mRNA水平表达(P0.05),增加了线粒体NF-κBp65、CytoC、Bax、caspase-3蛋白和mRNA表达(P0.05);同时增加线粒体ROS含量,降低线粒体ATP和膜电位(P0.05)。结论:甲酯化脂氧素A4通过抑制炎症反应和细胞凋亡,减轻早期脑出血后神经功能损伤,该神经保护作用可能是通过抑制NF-κB/MMP-9通路的激活来实现的。
【图文】：

点状伤口无渗血。造模术后 24h 处死大鼠，完整取出脑组织进行大体观。自血肿注入点冠状面切割，，观察发现尾状核邻近有一明显血肿，并且肿周围局部脑组织有损伤，此后观察到脑室有少量出血。综合以上观察果说明，大鼠 ICH 模型制备成功，符合进一步实验要求（Fig.1）。

固缩坏死的细胞和炎性细胞数量减少。ICH+ LXA4 ME-L 治疗组的织形态改变介于 Vehicle 组和 ICH+ LXA4 ME-H 治疗组之间。通过以上结果说明 LXA4 ME-H 治疗后能够明显减轻 ICH 后脑组织损伤，减少细胞坏死（Fig.2）
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.34

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本文编号：2664588