Atg7通过调控脑内皮细胞炎症因子的表达参与缺血性脑损伤的机制研究

发布时间：2020-05-17 03:18

【摘要】：背景和目的缺血性脑卒中(Ischemic stroke)是由脑动脉阻塞和血流灌注不足所引起的缺血性卒中,缺血性脑卒中占总脑卒中病例的87%。缺血再灌注损伤是在恢复或重新获得血液供应后的组织细胞内造成的损伤。造成缺血性损伤的原因,如炎症反应应答、兴奋性中毒、Ca~(2+)和Zn~(2+)的过载、扩散性去极化和游离自由基的产生,这些原因会造成不良后果,如由内皮细胞构成的血脑屏障的破坏、免疫细胞的侵润和神经元的凋亡等。炎症应答是发生在脑损伤后的主要事件,它既可以扩大缺血性脑损伤又可以帮助促进损伤的恢复。在炎症反应的早期,释放的促炎症因子和有害的自由基能加速细胞的损伤。脑缺血再灌注损伤阶段,由于脑损伤产生的促炎症因子可以使循环血中的免疫细胞、病原体和毒素等渗透入脑实质,造成二次损伤级联反应,如神经元的凋亡等。血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是一个高度特化的神经血管结构单元,由脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞等一起相互协调作用,构成调节血液中物质进出脑内的屏障结构,并能保持脑内微环境稳态。有文献报道血脑屏障的破裂很可能是脑卒中的脑实质损伤的一个原因。随着细胞自噬过程的发现和研究进展,自噬相关蛋白(Autophagy related protein)Atg7的重要作用得到了人们的广泛关注。Atg7在自噬和非自噬过程中都发挥了重要的作用。Atg7(E1-like activating enzyme)是巨自噬泛素系统中的核心蛋白,因此Atg7一直是研究的热点。为了揭示Atg7的功能,多种不同组织Atg7的条件性敲除小鼠被广泛研究。例如,体外自噬的抑制或Atg5/Atg7的干扰抑制体外VWF的分泌。使用VE-cadherin-Cre工具在内皮细胞中敲除Atg7可以减少VWF的释放,减少高分子量VWF多聚体的水平和出血时间,从而减少和改善血栓的形成。内皮细胞敲除Atg7可以促使体内博来霉素诱导的肺纤维化,说明完整的内皮细胞的自噬可以防止异常的EMT并限制器官的纤维化。在本实验室的前期研究中,在脑血管生成中,内皮细胞敲除Atg7能减少小鼠脑血管的密度。体外实验中,Atg7的表达降低也损伤了血管生成。进一步的研究表明Atg7能通过减少IL-6的表达来使血管生成减少,而VEGF的表达不受Atg7的影响。这些结果都说明Atg7具有促血管生成的作用。脑组织对缺血、缺氧非常敏感。如何保护缺血再灌注时脑细胞的功能,长期以来一直是脑血管疾病研究的热点。本研究论文主要讨论内皮细胞Atg7的敲除在脑缺血再灌注损伤中的作用和机制。研究方法一、脑内皮细胞中Atg7的敲除导致缺血再灌注小鼠的脑梗死体积减小及神经缺陷的改善组织免疫荧光-冰冻切片法检测内皮细胞Atg7敲除小鼠和WT小鼠脑组织中Atg7的表达。用短暂局灶性脑缺血模型(tFCI模型),检测内皮细胞Atg7的敲除对脑缺血再灌注损伤是否具有抵抗性。用神经功能缺陷评分法和运动功能损伤实验检测脑缺血再灌注损伤对Atg7eKO小鼠和WT小鼠的不同影响。二、Atg7 eKO小鼠显示出神经元凋亡减少及中性粒细胞侵润减少用TUNEL细胞凋亡法检测Atg7 eKO小鼠和WT小鼠脑冠状切片中的凋亡细胞数量。用Ly6B.2抗体组织免疫荧光染色检测Atg7 eKO小鼠和WT小鼠脑冠状切片中侵润的中性粒细胞数量。三、体内实验中,内皮细胞中Atg7的敲除导致脑纹状体和皮层中的促炎症因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的表达降低当发生短暂性脑缺血再灌注损伤后,制备Atg7 eKO小鼠和WT小鼠的两侧脑纹状体或皮层蛋白匀浆液,用ELISA检测促炎症细胞因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白表达。发生脑中动脉栓塞1小时后,当再灌注时间达到24小时时,分别提取Atg7 eKO小鼠和WT小鼠两侧脑纹状体及皮层的总RNA,用Real-time PCR检测促炎症因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA水平。四、在人脑微血管内皮细胞中,Atg7的表达降低能使促炎症因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的表达降低用人脑微血管内皮细胞,构建Atg7稳定干扰细胞株(Atg7 shRNA)和对照细胞株(Non-silencing shRNA)。建立氧糖剥夺再复氧细胞模型模拟在体脑缺血再灌注损伤模型。以常氧培养为对照,用ELISA法检测OGD/R时Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞株分泌或胞内的IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白水平。以常氧条件为对照,用Real-time PCR法检测OGD/R时Atg7 shRNA和non-silencing shRNA细胞株的IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-αmRNA表达水平。五、常氧和缺氧时,Atg7通过NF-κB信号通路调控脑微血管内皮细胞中促炎症因子(IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α)的产生,而不通过转录因子HIF-1α通路以常氧为对照,用WB检测OGD/R时Atg7的表达降低是否能导致NF-κB上游抑制因子IKKβ和IκBα的磷酸化水平降低。以常氧为对照,用WB和细胞免疫荧光检测OGD/R时Atg7的下调能否使NF-κB的功能亚单位p65(Rel A)入核减少。使用NF-κB激活剂Betulinic acid刺激HBMECs 24小时,Real-time PCR检测IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-αmRNA表达是否有补偿性地升高。常氧和缺氧发生时,用WB和细胞免疫荧光检测Atg7 shRNA和non-silencing shRNA细胞株的转录因子HIF-1α表达。六、Atg7通过NF-κB信号通路转录上调促炎症因子的表达是特异的使用小干扰RNA瞬时干扰Atg7时,ELISA和Real-time PCR检测IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的蛋白和mRNA水平如何变化。瞬时干扰Atg7时,ChIP检测转录因子p65与IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α启动子区DNA的结合。检测当3-MA和chloroquine影响自噬通路时,促炎症因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA表达如何变化。七、Atg7以NF-κB依赖方式调控脑微血管内皮细胞中促炎症细胞因子的产生的工作模式图用信号通路绘制软件绘制工作模式图。结果一、内皮细胞Atg7的敲除导致脑缺血再灌注小鼠的梗死体积减小及神经缺陷的改善血管内皮细胞Atg7敲除的小鼠的内皮细胞不表达Atg7,而WT小鼠的内皮细胞表达Atg7。脑缺血再灌注损伤后,Atg7 eKO小鼠比WT小鼠的脑梗死体积减小。脑缺血再灌注损伤后,Atg7 eKO小鼠表现为运动功能损伤更轻。二、Atg7 eKO小鼠显示出神经元凋亡减少及中性粒细胞的侵润减少与WT小鼠相比,脑缺血再灌注损伤发生后,Atg7 eKO小鼠的脑皮层中TUNEL阳性神经细胞的数量显著减少。与WT小鼠相比,脑缺血再灌注损伤发生后,Atg7 eKO小鼠的脑皮层中Ly6B.2阳性中性粒细胞的数目显著减少。三、体内实验中,内皮细胞Atg7的敲除导致脑纹状体和皮层中促炎症因子的表达降低脑缺血再灌注损伤后,Atg7 eKO小鼠手术侧脑纹状体或皮层中的促炎症因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的表达比WT小鼠更低。脑缺血再灌注损伤后,除IL-8/CXCL-15外,Atg7 eKO小鼠手术侧脑纹状体或皮层中促炎症因子IL-6,IL-1β和TNF-α的mRNA相对表达水平也低于WT小鼠。四、人脑微血管内皮细胞中,Atg7的表达降低能使促炎症因子的表达降低确定人脑微血管内皮细胞中Atg7的干扰效率。无论常氧或缺氧,在人脑微血管内皮细胞中,Atg7的表达降低能使促炎症细胞因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的分泌或胞内表达降低。无论常氧或缺氧,干扰Atg7的表达,HBMECs中促炎症因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA相对表达水平也降低。五、常氧和缺氧时,Atg7通过NF-κB信号通路调控脑微血管内皮细胞中促炎症细胞因子的产生,而不通过转录因子HIF-1α通路在常氧和OGD4hr/R24hr时,干扰Atg7的表达导致NF-κB上游抑制因子IKKβ和IκBα的磷酸化水平降低。同时,干扰Atg7的表达导致NF-κB的亚单位p65入核减少。NF-κB信号通路激活剂Betulinic acid能使促炎症因子IL-1β,IL-6和IL-8 mRNA相对表达升高,但对TNF-α的表达无影响。在常氧和OGD4hr/R24hr时,干扰Atg7导致促炎症因子表达下降与转录因子HIF-1α的表达无关。六、Atg7通过NF-κB信号通路转录上调促炎症因子的表达是特异的瞬时干扰Atg7可以模拟稳定干扰Atg7对促炎症因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的作用。转录因子p65对促炎症因子启动子的结合用ChIP进一步证明上述结果。自噬抑制剂3-MA和Chloroquine不能改变促炎症因子IL-1β,IL-8和TNF-α的mRNA表达,但可以使IL-6 mRNA表达升高。七、Atg7以NF-κB依赖方式调控脑微血管内皮细胞中促炎症因子的产生的工作模式图在脑微血管内皮细胞中,当缺血(糖)缺氧发生时,Atg7能通过NF-κB信号通路调控促炎症因子IL-6,IL-1β,IL-8和TNF-α的表达,促进细胞凋亡和中性粒细胞的募集和侵润。结论在短暂性脑缺血导致脑再灌注损伤发生后,Atg7 eKO小鼠表现为对脑损伤更有抵抗性。当血管内皮细胞缺乏Atg7时,小鼠在MCAO后的运动功能缺陷水平更低;脑损伤的梗死区域减小;脑皮层区的TUNEL阳性神经细胞数量更少,且有更少数量的Ly6B.2~+中性粒细胞侵润到脑实质中。体外实验,HBMECs中,Atg7的表达降低影响炎症因子的变化与体内实验基本一致;Atg7调控促炎症因子的变化是通过IKKβ-IκBα-NF-κB-p65信号通路的,与HIF-1α无关;Atg7调控NF-κB信号的特异性不能被自噬抑制剂所模拟。
【图文】：

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中国医科大学博士学位论文3 实验结果验证小鼠脑微血管内皮细胞 Atg7 的敲除效应使用 Atg7 基因两侧有 Lox P 的小鼠与表达 Cre 重组酶（在 VE-cadherin 启动控下）的小鼠杂交，产生内皮细胞特异性敲除 Atg7 基因的小鼠（Atg7 eKO织免疫荧光检测小鼠脑血管内皮细胞中 Atg7 的分布，在 WT 同窝对照小鼠中7 主要分布于血管内皮细胞和脑内其他细胞的细胞质中，而在 Atg7 eKO 小鼠7 并不分布于血管内皮细胞中，但可见分布于其他细胞的胞质中且 Atg7 与 CD的血管内皮细胞没有共定位，而在其他细胞的胞质中可见 Atg7 染色。

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图 2：用 PCR 和 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 WT 和 Atg7 eKO 小鼠的基因型。.3 脑内皮细胞中 Atg7 的敲除可以减少脑缺血再灌注造成的损伤为了检验小鼠血管内皮细胞中 Atg7 的敲除对小鼠脑神经损伤的影响，我们将T 和 Atg7 eKO 小鼠进行了脑缺血 1 小时/再灌注 24 小时的 I/R 模型。Atg7 eKO 小表现为脑缺血再灌注后脑损伤的体积减少和神经功能缺陷的降低（Longa 5 分法）。灌注 24 小时后，先对小鼠进行神经和运动功能的检测，随后取脑，2% TTC 染色，测脑梗死区域体积的大小。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

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