PTEN靶向降解短肽的表达及纯化条件的研究

发布时间：2020-05-20 02:34

【摘要】：中枢神经系统损伤后如何修复一直备受关注。近年来,文献报道神经元轴突的再生能力是影响神经元损伤修复的关键因素之一。研究结果证实,抑制PTEN基因激活m TOR的活性,能促进损伤神经元轴突的再生。因此,如何沉默PTEN激活m TOR就显得尤为重要。本文通过合成PTEN降解短肽,利用在原核表达系统中表达TAT-PDZ-CTM蛋白质,通过不同的层析原理进行纯化,筛选出获得高纯度蛋白的纯化条件,为后续进一步应用靶向PTEN降解蛋白,激活m TOR通路,研究损伤神经元轴突的再生机制提供高纯度的蛋白质。方法:1.利用分子生物学的方法构建TAT-PDZ-CTM序列。2.利用原核表达系统(大肠杆菌BL21感受态细胞)表达蛋白TAT-PDZ-CTM,在IPTG诱导表达的作用下,成功表达出高含量的蛋白。利用SDS-PAGE,Western blot方法检测,确定表达的蛋白是否正确。3.通过比较两种纯化方法,分别是纯化方法一:S75凝胶层析-超滤除盐及纯化方法二:复合阳离子层析-G-25凝胶除盐处理蛋白质,最后通过SDS-PAGE,HPLC检测方法鉴定纯化后样品纯度,并最终确定合适的纯化方法。4.通过TAT-PDZ-CTM作用类神经元细胞SH-SY5Y实验,利用Western blot方法检测胞内PTEN的表达情况,验证TAT-PDZ-CTM的活性。结果:1.成功构建出重组的表达载体p ET28a-TAT-PDZ-CTM。2.通过大肠杆菌的表达系统,利用IPTG诱导促进表达作用,表达出目的蛋白TAT-PDZ-CTM。3.针对序列设计时N端含有的6*His标签,特定的选择亲和层析纯化,有效地提纯蛋白质。4.通过纯化方法一:Ni亲和层析-S75凝胶层析-超滤除盐,获得的蛋白质纯度为94.31%,含量为0.27mg/ml;通过纯化方法二:Ni亲和层析-复合阳离子层析-G25凝胶除盐,获得的蛋白质纯度为98.57%,含量为1.20mg/ml。5.在正常细胞SY5Y中,按比例加入35μg/ml TAT-PDZ-CTM,通过Western Blot鉴定细胞内的PTEN被有效降解。结论:1.通过比较两种纯化方法,确定纯化方法二:复合阳离子层析-G25凝胶除盐方法及条件比纯化方法一:S75凝胶层析-超滤除盐方法及条件纯化蛋白TAT-PDZ-CTM,获得的最终样品纯度及含量更高,因此纯化方法二的层析步骤更适用于TAT-PDZ-CTM的纯化。2.成功表达出降解细胞内源蛋白PTEN的短肽TAT-PDZ-CTM。
【图文】：

图 3.1 TAT-PDZ-CTM 提取质粒电泳图带依次顺序为 M：Marker IV，1：质粒 TAT-PDZ-CTM-CTM 质粒的碱基序列鉴定结果（图 3.2）：图 3.2 TAT-PDZ-CTM 质粒序列比对

1 质粒提取后的鉴定结果1）按照质粒提取的操作步骤提取 pET28a-TAT-PDZ-CTM 质粒进行 1%糖电泳鉴定结果如下（图 3.1）：图 3.1 TAT-PDZ-CTM 提取质粒电泳图图注：条带依次顺序为 M：Marker IV，，1：质粒 TAT-PDZ-CTM2）TAT-PDZ-CTM 质粒的碱基序列鉴定结果（图 3.2）：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741

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本文编号：2671889