LGR5调控胶质瘤干细胞侵袭性及EMT机制的研究

发布时间：2020-05-29 03:06

【摘要】：研究背景胶质瘤作为成人颅内最常见的恶性肿瘤,术后极易复发,同时预后极差,目前研究广泛认为胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)以及由于上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)所导致的的侵袭性生长特征是导致胶质瘤术后复发的重要原因,然而胶质瘤干细胞和胶质瘤侵袭性的关系及其在肿瘤复发中的调控机制目前仍不清楚。近年来研究表明富亮氨酸重复序列G 蛋白偶联受体 5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,LGR5)是胃癌及结肠癌中的肿瘤干细胞标记物,然而LGR5是否可作为与EMT相关的胶质瘤干细胞标记物以及是否能够成为胶质瘤治疗的选择靶点需要进一步研究证实。目的探讨LGR5是否可以作为GSC标记物及其调控GSCs侵袭性和EMT的机制,进一步探讨LGR5对于预测胶质瘤生存期和复发时间的作用,为恶性胶质瘤的治疗提供新的靶点。方法1、对胶质瘤细胞系U87,U251,A172及原代胶质瘤细胞8591,LHH和7112的亲本细胞以及用无血清培养法对以上细胞进行富集培养后得到的富集细胞分别进行LGR5流式细胞检测,并分析其富集倍数;通过免疫荧光对以上细胞进行LGR5及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)定位检测;2、对U251和8591胶质瘤细胞进行LGR5流式细胞分选得到LGR5+和LGR5-细胞,分别进行细胞增殖实验、耐药实验、成球实验、侵袭和迁移实验以及体内成瘤实验等干细胞实验。3、在以上LGR5+和LGR5-细胞中,将LGR5与其他肿瘤干细胞(Cancer stemcells,CSCs)标记物 CD133,CD24,CD44,CD90及 EpCAM 分别以流式细胞法检测两组间各CSC标记物的表达水平。4、对以上U251和8591富集得到的干细胞分别进行LGR5敲降和过表达,通过Western blot检测以上CSC标记物和干性基因SOX2、Nanog和OCT4的表达水平,免疫荧光法鉴定LGR5和SOX2在GSCs中的表达和定位。5、对 LGR5 敲降组(shLGR5)、过表达组(Lenti-LGR5)及 Wnt-C59 治疗组的GSCs进行侵袭和迁移实验,通过Western blot检测各组中Wnt/β-catenin信号通路及EMT标记物的表达水平及变化。6、对shLGR5组、Wnt-C59治疗组和对照组(shCtrl)进行颅内原位移植瘤实验,小动物核磁检测颅内肿瘤生长速度并比较各组生存期差异。7、免疫组化法在胶质瘤标本中检测LGR5、N-cadherin及Ki67的表达并分析在各级别胶质瘤中的表达水平和关系,免疫荧光检测胶质瘤瘤体和瘤周LGR5的表达水平。8、Kaplan-Meier法比较低级别和高级别胶质瘤中LGR5高表达和低表达患者的总生存期(Overall survival,OS)和无进展生存期(Progression-free survival,PFS)。COX生存回归对低级别和高级别胶质瘤患者进行单因素和多因素生存分析。9、以上研究用到的统计方法包括方差检验、Studentt检验、Spearman相关分析、卡方检验和费舍尔精确检验。生存分析统计方法包括Kaplan-Meier、Log-rank test和Cox比例风险回归模型。结果1、流式细胞检测显示免疫荧光鉴定显示胶质瘤细胞系U251,U87,A172及原代胶质瘤细胞8591,LHH和7112的亲本细胞中LGR5阳性细胞比例分别为2.46%,2.01%,5.76%,1.34%,1.79%和1.45%;而富集得到的干细胞中LGR5 阳性比例分别为 21.50%,11.23%,16.04%,15.42%,11.41%和 4.53%,其LGR5的富集程度分别提高了 8.7、5.6、2.8、11.5、6.4和3.1倍;以上胶质瘤细胞均能够表达GFAP,而LGR5表达水平不尽相同。2、与LGR5-细胞相比,LGR5+细胞具有更强的体外增殖、耐药、侵袭、迁移、成球能力和体内致瘤性;免疫组化结果表明LGR5在体内肿瘤中与N-cadherin和Ki67具有显著相关性。3、流式检测表明LGR5+细胞中CSC标记物CD133、CD44、CD24和EpCAM表达升高,CD90无变化。同时在shLGR5的GSCs中CD133、CD44、CD24和EpCAM以及干性基因SOX2,Nanog表达水平下降,OCT4表达水平不变。免疫荧光表明富集得到的GSCs同时表达LGR5和SOX2。4、shLGR5组GSCs侵袭和迁移能力降低,Lenti-LGR5组GSCs侵袭和迁移能力增加,同时Western blot表明Wnt/β-catenin信号通路和EMT标志物的表达水平随着LGR5表达减少而降低,LGR5表达增加而升高;Wnt-C59治疗实验表明Wnt/β-catenin信号通路和EMT相关的细胞侵袭和迁移能力均以剂量依赖的形式被Wnt/β-catenin抑制剂Wnt-C59所抑制。5、颅内肿瘤生长曲线显示与对照组相比,shLGR5组和Wnt-C59组的肿瘤生长显著受到抑制;Log-rank test表明shLGR5组和Wnt-C59组的总生存期明显延长;同时颅内肿瘤免疫组化显示Ki67和Active-β-catenin的表达水平在shLGR5组和Wnt-C59组中显著减少,但二者之间无统计学差异;Spearman相关分析表明LGR5在颅内肿瘤的表达水平在shLGR5和shCtrl组中与Ki67和Active-β-catenin 呈正相关。6、免疫组化结果表明LGR5、Ki67和N-cadherin的表达水平均与胶质瘤等级呈正相关,同时Spearman相关分析证明LGR5在人胶质瘤标本中的表达水平与Ki67和N-cadherin相关。此外LGR5与N-cadherin共表达多见于胶质瘤侵袭度高的肿瘤外侧组织中。7、Log-rank test表明在高级别胶质瘤中,LGR5高表达组(LGR5high)PFS和OS更短,其中位PFS和OS分别为7.0个月和17.5个月,LGR5低表达组(LGR5low)中位PFS和OS分别为10.5个月和23.0个月;在低级别胶质瘤中,LGR5high组的PFS更短,而OS无统计学差异,LGR5high组中位PFS为23.5个月。8、单因素生存分析表明在高级别胶质瘤中,LGR5、瘤周水肿和同步放化疗和是PFS风险因素,LGR5、Karnofsky评分(KPS)、IDH1突变和同步放化疗是OS风险因素;多因素分析表明,LGR5和同步放化疗是独立的PFS预后因素,而LGR5、IDH1突变和同步放化疗是独立的OS预后因素。在低级别胶质瘤中,单因素分析表明IDH1突变和同步放化疗均是PFS和OS风险因素,而LGR5只是PFS风险因素;多因素分析表明LGR5是独立的PFS预后因素。P0.05为具有统计学意义。结论1、LGR5可作为一个新的功能性GSCs标记物,能够影响多种肿瘤干细胞标记物和干性基因的表达。2、LGR5在胶质瘤干细胞中通过上调Wnt/β-catenin信号通路促进EMT相关的细胞侵袭和迁移能力;3、LGR5是胶质瘤患者生存期的独立预后因素,未来可能成为一个重要的GSCs治疗靶点。本课题的重要创新点为:(1)首次提出并证实LGR5是一个新的功能性胶质瘤干细胞标记物,并明确了 LGR5与多种肿瘤干细胞标记物的关系。(2)在胶质瘤干细胞中首次证明LGR5能够促进其EMT转化并揭示其调控机制。(3)通过裸鼠颅内原位实验证明了 LGR5能够作为一个有效的GSCs治疗靶点。
【图文】：

２．２细胞增殖实验逡逑细胞增殖实验发现，Ｕ２５１细胞中分选的ＬＧＲ５＋细胞比ＬＧＲ５－具有更强的体逡逑外增殖能力（图５Ａ，Ｐ＜邋０．００１，，邋ｎ邋＝邋５），在８５９１原代细胞中也发现了类似的结逡逑果（图邋５Ｂ，Ｐ＜０．００１，ｎ邋＝邋５）。逡逑Ａ邋１５１逦—邋ＬＧＲ５＊逦８邋１0１逦－邋ＬＧＲ５＊逡逑

北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文逦逡逑Ｆｉｇ．５邋Ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙｓ邋ｏｆ邋ＬＧＲ５＋邋Ｕ２５１邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋ＬＧＲ５－邋Ｕ２５１邋ｃｅｌｌｓ邋（ｔｗｏ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ．逡逑Ｐ＜邋０．００１）．逦０．００１．逡逑２．邋３细胞克隆成球实验逡逑通过细胞成球实验，我们发现ＬＧＲ５＋胶质瘤细胞形成的克隆球体数量明显逡逑多于ＬＧＲ５－胶质瘤细胞，并且干细胞球的体积明显大于ＬＧＲ５－胶质瘤细胞形成逡逑的球体（图邋６Ａ，Ｐ＜０．０１，ｎ邋＝邋５；图邋６Ｂ，Ｐ＜０．００１，ｎ邋＝邋５），这说明邋ＬＧＲ５＋细胞逡逑具有更强的克隆成球能力。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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本文编号：2686292