Ars2通过microRNA-6798-3p调控胶质瘤细胞凋亡的分子机制研究

发布时间：2020-06-02 03:38

【摘要】：恶性胶质瘤(Malignant Glioma)是一种较为常见且致命的脑部肿瘤,其往往又预示着患者高发病率以及高死亡率。胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种较常见的原发性恶性胶质瘤,其预后不良。在过去的十年内并没有更为有效的治疗方法出现。结合现今的医疗手段,包括外科手术治疗以及放射治疗和化学药物治疗的应用,患者诊断后的生存期望也仅有14个月左右。胶质瘤的基因表达或大或小的改变,引起了调控细胞增殖、细胞凋亡、血管生成以及转移侵袭的相关调控基因表达的改变。然而,具体的由调控基因改变引起的细胞增殖和细胞凋亡异常的分子机制至今尚不明确。因此,详尽分析这些变化的调控基因可为胶质瘤患者的诊断、预后以及临床治疗提供新的靶标。砷素拮抗蛋白-2(Arsenic-resistance protein-2,Ars2)是由人类的SRRT基因编码的核蛋白。其c DNA的部分片段首次克隆于仓鼠细胞系,当时的研究认为Ars2是一种可以拮抗砷盐毒性的蛋白。后续研究发现,Ars2也是一个RNA沉默诱导机制的影响因子,在果蝇中其与抗病毒能力相关,在哺乳动物中则认为其与细胞增殖调控相关。通过多年的研究总结发现,Ars2蛋白的部分区段与拮抗砷盐毒性相关,而其全长蛋白则通过调控RNA代谢调节细胞增殖。同时Ars2也被认为是核内帽式结构复合体CBC(Nuclear Cap-binding Complex)的组分之一,与mi R-155、mi R-21以及let-7的生物学合成相关,并以此调控细胞增殖。也就是说,Ars2的敲降可有效的下调一些micro RNA(mi RNA)的表达。最近,学者发现Ars2在人类的肝癌(Human Hepatocellular Carcinoma,HCC)和胆管细胞癌(Cholangiocarcinoma)中高表达,并且研究认为其可以作为临床的诊断或预后指标,甚至是治疗靶标。然而却没有直接的证据指出,Ars2在胶质瘤中发挥类似的作用。在本文的研究中我们发现Ars2在调控胶质瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用,并且影响了其在体内的成瘤能力。功能研究发现,Ars2的敲降会引起mi RNA-6798-3p的表达下调,进而导致p53和p21表达上调,最终引起细胞凋亡。这些发现都将为胶质瘤患者的临床治疗提供新视野。本研究获得的主要研究结果如下:1.Ars2高表达与患者不良预后相关为确定Ars2是否可以成为胶质瘤患者的预后指标,研究前期我们通过查询网络数据平台R2,利用Kaplan-Meier分析方法对Frence数据库的胶质瘤患者进行预后评估。结果表明,Ars2高表达患者(78例)的3年存活率为10%,而Ars2低表达患者(195例)的3年生存率为39%;Ars2高表达患者的5年存活率为6%,而Ars2低表达患者的5年生存率为28%。同时我们也发现Ars2高表达于胶质瘤细胞系(U87,LN229,A172,U118,U251),而低表达于正常人脑星形胶质细胞(normal human astrocytes,HA)。也就是说Ars2普遍表达于胶质瘤细胞,而并非是某一种胶质瘤的特例。以上结果表明,在胶质瘤患者中,Ars2的高表达与病人的不良预后相关。我们推测或许Ars2可以作为胶质瘤治疗的新靶点。2.Ars2通过调控p53/p21信号通路调控胶质瘤细胞凋亡进一步研究发现,在胶质瘤细胞系U87和LN229中,Ars2的敲降诱导细胞凋亡发生。随后我们又利用Western Blot分析法检测Ars2敲降后p53及其下游的p21蛋白的表达情况,笔者发现p53与p21的蛋白表达量显著增强。此外,利用含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)抑制剂(z-VAD-fmk)处理Ars2敲降的细胞后,细胞凋亡受到明显抑制。也就是说Ars2敲低诱导的细胞凋亡是通过caspase路径实现的。为排除脱靶效应,笔者在Ars2敲低的细胞系中过表达Ars2并检测其对Ars2敲低诱导的细胞凋亡的影响,结果显示在Ars2敲降的细胞系中过表达Ars2可抑制细胞因Ars2敲降诱导的细胞凋亡。同时利用si RNA对敲降Ars2细胞中的p53以及p21进行特异性的干扰,结果进一步证明,Ars2的敲降诱导p53/p21依赖的细胞凋亡的发生。3.Ars2通过mi RNA-6798-3p调控胶质瘤细胞凋亡据报道,Ars2在mi RNA的生物学合成过程中发挥着重要的作用。所以在后续的研究过程中,我们利用了广州锐博公司提供的高通量mi RNA芯片,比较sh Con-U87与sh Ars2-1#-U87细胞中的mi RNA的表达情况,筛选其中表达下调倍数大于2的mi RNA。随后我们得到了25个表达下调的mi RNA。同时利用mi RNA的q RT-PCR技术我们确定了mi RNA-6798-3p在U87和LN229敲降Ars2后表达下调。为了进一步验证mi RNA-6798-3p是否参与到Ars2敲低诱导的U87和LN229细胞凋亡的过程中。我们利用mi RNA-6798-3p人工合成产物mi RNA-6798-3p mimic以及流式细胞术(Flow Cytometry)检测mi RNA-6798-3p对Ars2敲低诱导的细胞凋亡的影响。结果显示,共转染mi RNA-6798-3p mimic以及sh Ars2后可以抑制由Ars2敲低诱导的U87和LN229细胞凋亡。Western Blot结果也显示共转染两者可逆转因Ars2敲低导致的p53、p21以及激活/剪切态含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(actibation/cleaved-caspase3,C-Caspase3)蛋白表达的上调。以上结果表明,Ars2通过调控mi RNA-6798-3p调控胶质瘤细胞凋亡。4.Ars2对胶质瘤细胞原位肿瘤形成能力的影响为验证Ars2的敲低是否在体内可抑制胶质瘤细胞增殖,我们构建了NOD/SCID鼠原位移植瘤模型。研究发现,通过等量原位注射U87-sh Con以及U87-sh Ars2-1#细胞,对应荷瘤鼠在注射细胞后的存活时间分别为42.2±3.9天和82.2±16.5天,且具有显著性差异。同时我们也发现,注射sh Con细胞的NOD/SCID鼠的脑部肿瘤占据了将近整个的右半球,而在sh Ars2-1#介入之后脑部肿瘤变得几乎不可见。为进一步的研究Ars2敲低后引起的病理学变化,通过HE染色技术,我们发现注射sh Con-U87细胞的NOD/SCID鼠的脑部切片中存在大量的肿瘤细胞,相反的注射了sh Ars2-1#-U87细胞的NOD/SCID鼠的脑部切片中几乎观测不到肿瘤细胞。随后我们利用免疫组化染色法对NOD/SCID鼠的大脑进行特异性染色,发现在注射sh Con-U87细胞后NOD/SCID鼠的大脑有明显的Ki-67信号,然而在Ars2敲低组内NOD/SCID鼠大脑内的表达Ki-67的细胞较少。为了进一步确定Ars2的敲低是否成功,我们同样的利用免疫组化的方法对Ars2的表达进行检测。结果显示,Ars2阳性细胞在sh Ars2-1#组的小鼠大脑切片内要明显少于sh Con组。综上所述,Ars2可以影响胶质瘤细胞的体内成瘤能力。除此之外,本人还开展了麦冬皂苷D(Ophiopogonin D,OP-D)对乳腺癌细胞自噬调控的研究,并获得如下实验结果:5.OP-D可诱导乳腺癌细胞自噬降解抑制OP-D是一种甾体糖苷,提取自百合科植物麦冬,近些年来的研究发现,OP-D可以靶定多条通路进而抑制肺癌细胞增殖。在本文中我们发现通过转染绿色荧光质粒EGFP-LC3,经药物处理后,细胞内发现大量的荧光团。利用Western blot检测细胞自噬相关调控蛋白SQSTM1、LC3B、LAMP1以及BECN1的表达水平,结果显示,SQSTM1、LC3B-II以及LAMP1会随着OP-D浓度以及作用时间的累积而增强,而BECN1的表达却没有变化。同时共处理细胞自噬降解抑制剂Bafilomycin A1(Baf)和细胞自噬激动剂Rapamycin(Rapa)结果显示,OP-D的作用与Baf作用类似。也就是说OP-D抑制了乳腺癌细胞自噬降解过程。6.OP-D可以通过抑制微管蛋白α-Tubulin乙酰化进而抑制细胞自噬降解根据EGFP-LC3转染结果显示,OP-D处理乳腺癌细胞后,细胞内的自噬体呈现分散状态而非聚集状态,我们推测细胞微管蛋白α-Tubulin发生变化。通过Western blot分析法我们确定α-Tubulin的乙酰化受阻。也就是说OP-D是通过抑制微管蛋白乙酰化进而抑制了乳腺癌细胞自噬降解。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

【相似文献】