血浆外泌体源性miR-122-5p和miR-300-3p作为诊断大鼠短暂性脑缺血发作潜在标记物的研究

发布时间：2020-06-04 03:02

【摘要】：目的:缺血性脑卒中是全世界最主要的致残性疾病和第二大致死性疾病,严重威胁着人类健康及生活质量。短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack,TIA)与缺血性脑卒中在溶栓时间窗内难以鉴别。然而,其治疗方法极为有限。发病后极早期静脉溶栓或血管内取栓是目前国际循证指南推荐的有效治疗手段,但其治疗时间窗窄,仅极少数病人获益。提高患者静脉溶栓或血管内取栓比例的关键是在时间窗内鉴别短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack,TIA)与缺血性脑卒中。虽然不断发展的影像诊断技术,能在有限的治疗时间窗内证实TIA的诊断,但因其技术复杂和费用高昂而使得这些技术难以普及。血液标志物检测具有非创伤性、快速及价格低廉等优点,并已有大量血液标志物被研究应用于疾病的诊断或预后判断等,然而针对TIA诊断的血液外泌体源性miRNA标志物迄今未见报道。为此,我们将探讨血浆外泌体源性rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p在大鼠短暂性脑缺血发作中的潜在诊断价值。方法:通过阻塞大脑中动脉,建立5 min、10 min、2 h时的大鼠脑缺血模型,并设置假手术组进行对照。使用HE染色法和TUNEL染色法,对脑组织缺血受损程度进行评估。通过试剂盒提取大鼠血浆和脑脊液的外泌体以及外泌体源性RNA,运用透射电子显微镜、Nanosight检测、免疫印迹试验对提取出来的外泌体进行检测。利用深度测序技术寻找在大鼠脑脊液和血浆中表达趋势一致的外泌体源性miRNA,并运用qRT-PCR方法加以验证。采用单因素方差分析Games-Howell检验方法对不同分组中的血浆外泌体源性miRNA表达量进行比较,并通过ROC曲线评价这些mi RNA作为诊断大鼠短暂性脑缺血发作标志物的价值。结果:采用试剂盒成功从大鼠血浆和脑脊液中提取出外泌体,脑脊液外泌体颗粒大小峰值为123.7 nm,血浆外泌体颗粒大小峰值为148.1 nm;免疫印迹试验可以检测出外泌体特异性标记蛋白HSP70和CD63,均符合经典外泌体的标准。通过深度测序和qRT-PCR技术筛选出rno-miR-122-5p、rno-miR-300-3p作为大鼠短暂性脑缺血发作的生物标志物。与假手术组和脑缺血5 min组的大鼠相比,脑缺血10 min的大鼠其血浆外泌体源性rno-miR-122-5p的表达显著下调。而与假手术组、脑缺血10 min组和脑缺血2 h组的大鼠相比,脑缺血5 min的大鼠其血浆外泌体源性rno-miR-300-3p的表达显著上调。并且这两个外泌体源性miRNA在血浆和脑脊液中是存在相关性的(rno-miR-122-5p:R=0.632,P0.005;rno-miR-300-3p:R=0.719,P0.001)。ROC曲线分析结果显示:与假手术组相比,rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p分别在脑缺血10 min、5 min的大鼠展现出了极高的诊断价值,其ROC曲线下面积分别为0.960和0.970。结论:本研究成功分离出大鼠血浆、脑脊液中的外泌体;通过大鼠大脑中动脉阻塞模型(缺血5分钟、10分钟)成功模拟短暂性脑缺血发作;血浆外泌体源性miRNA-122-5p和miR-300-3p有可能成为诊断大鼠短暂性脑缺血发作的一种潜在生物标志物。
【图文】：

存在差异,凋亡细胞,脑缺血,域典

域典,组织病理变化

Fig. 1: (A) Representative histopathologic findings in the frontoparietal cortex are shown by TUNELstaining. (B) TUNEL-positive cell ratios of different ischaemia groups (*P<0.001 VS sham; #P<0.001 VS 5min ischaemia group; &P<0.001 VS 10 min ischaemia group)
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.31

【参考文献】