基于多价核酸适体的胶质母细胞瘤检测及胶质瘤外泌体核酸适体筛选
发布时间：2020-06-07 08:30
【摘要】：目的:1.利用2条特异性的、高亲和力的胶质母细胞瘤核酸适体的形成多价核酸适体探针,增强对靶标胶质母细胞瘤细胞系T98G的识别灵敏度。2.筛选获得针对人脑胶质瘤分泌的外泌体的高亲和力、高特异性的核酸适体,作为一种新型分子探针用于甄定和分选胶质瘤外泌体。方法:1.利用本实验室通过Cell-SELEX技术筛选获得的2条胶质母细胞瘤细胞系T98G的核酸适体WYZ-41a、WYZ-50a,利用流式细胞仪鉴定两条核酸适体的协同作用,通过荧光共聚焦显微镜证明核酸适体对在靶标细胞膜上的共定位作用。同时在血清、脑脊液中检测核酸适体在生理环境中的稳定性及结合能力,进一步考察其实际应用。2.通过差速离心法,分离纯化人胶质瘤细胞SHG44分泌的外泌体,利用流式细胞仪和透射电镜验证其生物学和形态学特征。利用之前本实验室通过CellSELEX技术筛选获得的人胶质瘤细胞系SHG44的核酸适体文库,以流式细胞仪分析并筛选得到对SHG44外泌体结合能力最强的核酸适体。通过软件模拟其二级结构,在保留主要茎环结构的情况下对其进行截短优化。选择其他胶质瘤细胞系产生的外泌体,以流式细胞仪分析核酸适体的选择性。在血清、脑脊液中检测核酸适体在生理环境中的结合力,进一步考察其实际应用。通过胰酶消化实验核酸适体的靶标性质,并通过质谱技术检测其结合的靶标。结果:1.核酸适体WYZ-41a、WYZ-50a之间存在协同作用,同时结合于T98G细胞膜上。激光共聚焦可见核酸适体WYZ-41a、WYZ-50a在细胞膜上部分重叠。在血清、脑脊液中稳定性良好,并且能在血清、脑脊液中对靶标细胞保持良好的结合能力和特异性。2.通过差速离心法分离纯化的胶质瘤细胞SHG44产生的外泌体,在电镜下呈现磷脂双分子层囊泡样结构,直径在40-100nm范围内。流式细胞仪可见外泌体特异性蛋白标志物CD63呈阳性表达。以流式细胞技术分析人胶质瘤细胞SHG44核酸适体文库,其中核酸适体S12亲和力和特异性均最佳。通过模拟核酸适体二级结构,在保留主要茎环结构的前提下对其截短优化。37℃条件下,截短的核酸适体S12-4在血清、脑脊液等生理环境中对靶标依然保持良好的结合能力和特异性。与预先经过胰酶处理的外泌体孵育,S12-4丧失原有的结合能力。利用修饰了Biotin的核酸适体来初步甄定人胶质瘤细胞SHG44外泌体表面的生物标志物。结论:1.核酸适体WYZ-41a、WYZ-50a存在协同作用,并且共定位于细胞膜上,在生理环境下的稳定性和对靶标细胞的结合能力良好,可以作为胶质母细胞瘤的一种新型分子探针,将在胶质母细胞瘤的早期诊断、术中荧光、监测预后、生物标志物甄定等方面发挥重要作用。2.筛选获得的胶质瘤细胞SHG44外泌体特异性核酸适体S12-4能够区分胶质瘤细胞SHG44外泌体与其他胶质瘤细胞系外泌体,可以作为外泌体分选探针。并且能在生理环境下依然保持其生理活性。经过胰酶消化实验证明核酸适体S12-4结合的靶标为蛋白类物质,初步甄定得到的生物标志物为热休克蛋白70(HSC70),有望在脑胶质瘤早期诊断和肿瘤预后评估等领域发挥独特作用。
【图文】：
加入 300 μL 结合缓冲液重悬细胞，使细胞保持单测各组细胞与核酸适体结合后的荧光值。以 Cy5每管分别计数 10000 个细胞，每组重复三遍。结果与分析适体 WYZ-41a、WYZ-50a 的协同作用核酸适体解离常数（dissociation constant, Kd）， 达到平台值，，通过流式细胞技术检测结果可以发从 100 nM 增加到 200 nM 时荧光强度无明显酸适体 WYZ-50a 在细胞表面已经达到饱和。同 和 100 nM WYZ-41a 的荧光强度明显增强，说 结合于靶标细胞 T98G 上的不同靶点，可以形成 T98G 的识别能力。
13图 1.2 激光共聚焦荧光显微镜细胞成像。Cy5 荧光基团标记的 WYZ-41a 和 FITC荧光基团标记的 WYZ-50a 分别或共同与靶标细胞 T98G 和脑正常星形细胞SVGp12 结合。以同样带有两种荧光基团的随机序列作为对照。Hochest 染细胞核，核酸适体终浓度 400nM。Fig. 1.2 Fluorescence confocal images of T98G and SVGp12 cells incubated with Cy5-labeled aptamer WYZ-41a and FITC-labeled aptamer WYZ-50a. Fraction of initialLibrary labeled with Cy5 and FITC, which did not bind to T98G cells, were used ascontrol. Column 1 is the Hochest channel, column 2 is the Cy5 channel, column 3 is theFITC channel and column 4 is the overlay of the Cy5 and FITC channels. Cells in row 1,3 were incubated with Initial Library-FITC (control) and Initial Library-Cy5 (control).Cells in row 2, 4 were incubated with aptamer WYZ-41a-Cy5 and aptamer WYZ-50a-FITC. The final concentration of WYZ-41a, WYZ-50a and initial library was 400 nM.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
本文编号：2701150
【图文】：
加入 300 μL 结合缓冲液重悬细胞，使细胞保持单测各组细胞与核酸适体结合后的荧光值。以 Cy5每管分别计数 10000 个细胞，每组重复三遍。结果与分析适体 WYZ-41a、WYZ-50a 的协同作用核酸适体解离常数（dissociation constant, Kd）， 达到平台值，，通过流式细胞技术检测结果可以发从 100 nM 增加到 200 nM 时荧光强度无明显酸适体 WYZ-50a 在细胞表面已经达到饱和。同 和 100 nM WYZ-41a 的荧光强度明显增强，说 结合于靶标细胞 T98G 上的不同靶点，可以形成 T98G 的识别能力。
13图 1.2 激光共聚焦荧光显微镜细胞成像。Cy5 荧光基团标记的 WYZ-41a 和 FITC荧光基团标记的 WYZ-50a 分别或共同与靶标细胞 T98G 和脑正常星形细胞SVGp12 结合。以同样带有两种荧光基团的随机序列作为对照。Hochest 染细胞核，核酸适体终浓度 400nM。Fig. 1.2 Fluorescence confocal images of T98G and SVGp12 cells incubated with Cy5-labeled aptamer WYZ-41a and FITC-labeled aptamer WYZ-50a. Fraction of initialLibrary labeled with Cy5 and FITC, which did not bind to T98G cells, were used ascontrol. Column 1 is the Hochest channel, column 2 is the Cy5 channel, column 3 is theFITC channel and column 4 is the overlay of the Cy5 and FITC channels. Cells in row 1,3 were incubated with Initial Library-FITC (control) and Initial Library-Cy5 (control).Cells in row 2, 4 were incubated with aptamer WYZ-41a-Cy5 and aptamer WYZ-50a-FITC. The final concentration of WYZ-41a, WYZ-50a and initial library was 400 nM.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【参考文献】
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1 李咏梅;赵庆欢;;核酸适配体修饰的纳米脂质体的制备及靶向毒性研究[J];化学与生物工程;2015年08期
本文编号：2701150
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