治疗视神经脊髓炎全人源抗C5单链抗体的研究

发布时间：2020-06-10 18:02

【摘要】：研究目的:视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一种中枢神经系统(Central nervous system,CNS)自身反应性炎性脱髓鞘疾病,主要累及脊髓和视神经,还可累及脑实质。研究表明NMO的主要病理特征为水通道蛋白-4(Aquaporin 4,AQP4)自身抗体(AQP4-immunoglobulin G,AQP4-IgG)结合星形胶质细胞表面的AQP4后,激活补体,导致一系列炎症反应,造成星形胶质细胞丢失、少突神经胶质细胞受损和神经元死亡。目前NMO的治疗方式主要是免疫调节及血浆置换,但患者仍有较高的死亡率或严重的后遗症。单克隆抗体用于治疗NMO正受到越来越多的关注,例如,利妥昔单抗(Rituximab)、依库珠单抗(Eculizumab)和托珠单抗(Tocilizumab)等单克隆抗体药物已经进入临床试验阶段,部分抗体药物已经展现出较好的临床效果。但是,当前开展临床试验的该类药物多数为鼠源的单克隆抗体,长期应用有引起患者的人抗鼠免疫原性反应(Human anti-mouse anti-antibody,HAMA)的潜在风险。本研究的目的是通过体外噬菌体展示技术从全人源单链抗体库中筛选出能够特异性结合补体C5(Complement C5,C5)的单链抗体(Single-chain variable fragment,scFv),并明确其对NMO疾病模型的治疗效果。研究方法:本研究利用噬菌体展示体外固相筛选技术从噬菌体抗体库(6×10~(10))中筛选能够特异性结合C5的单链抗体。经过5轮的筛选(吸附-洗脱-扩增),随机挑选了239个噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)验证其与补体C5的结合能力和结合特异性。根据ELISA多次重复的实验结果,选择在A450 nm数值较高的部分克隆进行核酸序列测定,使用DNAMAN进行序列多样性分析和序列比对,确定重复序列较高的阳性克隆。将重复序列最高的3个基因插入到原核表达载体pET30a(带有his标签)中。在低温(16°C)条件下培养,使用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,简称IPTG)诱导单链抗体基因在大肠杆菌BL21中可溶性表达。离心收集菌体后进行蛋白纯化,经过亲和层析、DEAE层析、Butyl层析一系列的纯化得到纯度在90%以上的可溶性单链抗体;用超滤管浓缩蛋白浓度至40 mg/mL用于后续实验;通过SDS-PAGE变性胶观察蛋白的片段大小,应用Western Blot、ELISA法鉴定可溶性单链抗体与补体C5结合的特异性;进一步用Biacore T200进行单链抗体与C5结合的亲和力和浓度依赖情况的检测,从而确定单链抗体的亲和力与补体C5的结合情况。挑选特异性较好的单链抗体作用于NMO体外和动物实验模型以明确目标单链抗体对NMO的治疗效果:利用AQP4-IgG和人补体(human complement,hC)作用于稳定表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsters ovary,CHO)模拟NMO的体外实验模型,通过LIVE/DEAD染色的方法验证筛选得到的单链抗体对NMO细胞模型细胞毒性的影响;选择脑实质注射NMOSD血清阳性患者的抗体(IgG_(NMOSD))和人补体在体内模拟视神经脊髓炎的发病情况,通过相关组织染色确定病灶及炎症细胞的变化,并进一步明确筛选得到的单链抗体对NMO的保护效果。结果:1.经过5轮噬菌体筛选得到了8个抗体序列(C5B3、C5B35、C5B98、C5B106、C5A6、C5A102、C5A121、C5A152)。将同源性最高的3个序列原核表达后进行一系列纯化,获得了纯度在90%以上的可溶性单链抗体。2.对纯化后的可溶性单链抗体(C5B3、C5A6、C5B35)进行了体外功能验证。结果表明,C5B3明显减少了稳定表达AQP4的CHO细胞的补体依赖性的细胞毒性作用,明显减少了膜攻击复合物的形成及死亡细胞的数量,且该作用具有明显的C5B3浓度依赖性。3.对单链抗体C5B3进行了体内功能验证。在NMO动物模型中,C5B3明显减小了脑实质注射IgG_(NMOSD)和人补体引起的病灶体积和炎症细胞的浸润,并且能够减少体内膜攻击复合物的形成。结论:通过对全人源性噬菌体抗体库的筛选获得了特异性结合补体C5的单链抗体,经过体外及体内实验证实得到的1个单链抗体(C5B3)能够减少AQP4-IgG和人补体造成的细胞毒性,对NMO动物模型也能发挥一定的保护作用。
【图文】：

噬菌体抗体,噬菌体,噬菌体抗体库,包被

32图 1.经过五轮的噬菌体筛选得到能与补体 C5 结合的噬菌体抗体。将用 0.1 M pH9.6 碳酸钠碳酸氢钠溶液稀释补体 C5（母液为 1mg/mL）后包被 ELISA 孔板，每轮包被的抗原量为 800 ng、600 ng、500 ng、 400 ng、300 ng，包被体系每孔 50～100μl，4°C 过夜；随着筛选轮数的增加，包被抗原的量逐渐较少，通过 ELISA 实验检测得到的五轮的噬菌体抗体库与目的蛋白补体 C5 的结合情况，在筛选进行至第五轮时，挑选部分噬菌体克隆检测与补体C5 的结合情况。（A）随着筛选的进行 PCR 结果显示阳性克隆逐渐增多；（B）ELISA 结果显示随着筛选的进行噬菌体抗体库与补体 C5 的在 A450 nm 的数值逐渐增加，结合力逐渐增强，在筛选进行至第 4 轮和第 5 轮时变化相对平缓；（C）在第 5 轮时，挑选 239 个单个噬菌体克隆进行 ELISA 实验，不同的噬菌体克隆与补体 C5 结合是不同的。2.2 构建同源性较高的抗体序列至原核表达载体通过噬菌体抗体 ELISA 和测序得到 8 个单链抗体，，根据 ELISA 鉴定结果选

单链抗体,可溶性,测序

天津医科大学博士学位论文择亲和能力较强和同源序列较高 C5B3、C5A6 和 B5B35 进行可溶性单链抗体的原核表达。将 C5B3 单链抗体基因构建至原核表达载体 pET28a、PGEX-4T、pET30a 内，挑取单个克隆做菌落 PCR，单链抗体的核酸序列约 750 bp，阳性率为 100%，结果如图 2A，初步判断 C5B3 基因构建至原核表达载体内，为进一步确认载体构建成功挑选部分阳性克隆测序，测序结果进行序列分析，序列分析主要是通过 DNAMAN 比对测序所得的片段和 C5B3 基因片段是否完全一致，和C5B3 目的基因插入的位置是否正确；以 pET-30a 为例进行说明，图 2B 为pET30a-C5B3 构建载体的模式图。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R744.52

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